Кафедра клинической иммунологии

Кафедра клинической иммунологии

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Учебное пособие для студентов 6 курса лечебного и педиатрического факультетов

 

Составил: доц. Сенникова Ю.А.

 

Новосибирск 2011

Содержание.

Предисловие……………………………………………………………….……………..2

Введение…………………………………………………………………………….…....3

1. Области использования иммунодиагностики…………………………………….....4

2. Иммунологические методы в диагностике заболеваний иммунной системы….…6

2.1. Количественное определение популяций лимфоцитов……….…………...…..8

2.1.1. Проточная цитометрия…………...………………………….…………….8

2.1.2. CD-классификация мембранных молекул иммунокомпетентных клеток……………………………………………………………………………………10

2.1.2. Маркеры активации лимфоцитов………………….…………………….10

2.2. Методы оценки функциональной активности лимфоцитов………………….12

2.2.1. Определение пролиферативной способности лимфоцитов……………12

2.2.2. Определение цитотоксической активности Т-лимфоцитов…...……...13

2.2.3. Оценка ГЗТ in vivo ……………………………………… ……………….13

2.2.4. Оценка цитотоксической активности естественных киллеров………..14

2.2.5. Методы количественного определения иммуноглобулинов………….14

2.3. Методы исследования функций фагоцитов........................................................16

2.3.1. Методы определения хемотаксиса лейкоцитов……………..…………..17

2.3.2. Определение адгезивных свойств…………………………..……………17

2.3.3. Определение фагоцитарной способности……………….………………18

2.3.4. Оценка бактерицидной активности………………………………………18

2.4. Методы оценки системы комплемента…………………………………………19

3. Иммунологические методы, основанные на реакции антиген-антитело. ………20

3.1. Иммуноферментный анализ……………………………...…………………….21

3.2. Радиоиммунный анализ………………………………………………...……….22

3.3. Иммунофлюоресцентный анализ…………..…………………………………..22

4. Методы исследования цитокинов…………………………..………………………24

Заключение…………………………………………………………………………..….25Вопросы для самоконтроля ………………………………...………………………….25

Задания в тестовой форме……………………………………………………...………26

Словарь иммунологических терминов………………………………………………..29
Библиографический список…………………………………………………………....32

Предисловие.

Согласно определению ВОЗ клиническая иммунология – это клиническая и лабораторная дисциплина, занимающаяся изучением вопросов диагностики и лечения больных с различными заболеваниями и патологическими состояниями, в основе которых лежат иммунологические механизмы, а также состояниями, в терапии и профилактике которых иммуноактивные препараты играют ведущую роль. Обращает на себя внимание то, что иммунология – это и лабораторная дисциплина. Сложилось так, что иммунологические методы используются очень широко в различных областях медицины. Главным образом, это методы, основанные на иммунных реакциях (антиген+антитело, ГЗТ). Одной из задач клинической иммунологии в современной медицине является обогащение ее иммунологическими подходами к диагностике и лечению заболеваний.

Данное пособие адресовано студентам лечебного и педиатрического факультетов, изучающим клиническую иммунологию, в частности, при подготовке поразделу 2 «Оценка иммунного статуса. Иммунодиагностика», темы 2 «Методы оценки иммунного статуса и их клиническая интерпретация» учебно-методического плана. Пособие содержит развернутый систематизированный материал по данной теме, освещающий возможности современной иммунодиагностики, области использования иммунологических методов в различных областях клинической медицины, методологию иммунодиагностики основных заболеваний иммунной системы, основные иммунологические методы. Настоящее учебное пособие будет способствовать формированию представлений о принципах иммунодиагностики; приобретению знаний о показаниях для исследования иммунного статуса, количественных и функциональных тестах оценки Т-клеточного, В-клеточного иммунитета, НК-клеток, фагоцитоза, комплемента и их клинического значение, умений определять показания для исследования иммунного статуса, интерпретировать основные показатели иммунного статуса.

Изучение данного вопроса предполагает преемственность и базируется на знаниях, приобретенных студентами на младших курсах при изучении смежных дисциплин (микробиология, общая биология, и др.). В то же время, полученные студентами знания могут быть востребованы при изучении целого ряда других клинических дисциплин образовательной программы (гематология, трансплантология, онкология, инфекционные болезни и др.).

Настоящее пособие посвящено 2 и 3 разделам рабочей программы по дисциплине “клиническая иммунология”.

 

Введение.

Впервые методология иммунодиагностики заболеваний иммунной системы была разработана в нашей стране Р.В. Петровым и соавторами, опубликовавшими в 1984 г. методические рекомендации «Оценка иммунного статуса человека». В соответствии с этими методическими рекомендациями все методы иммунодиагностики разделены на тесты I и II уровней. Тесты I уровня направлены на идентификацию грубых поломок иммунной системы, т.е. первичных иммунодефицитов; тесты II уровня – на углубленное изучение функционального состояния иммунной системы. К тестам I уровня относят:

– определение функциональной активности фагоцитов;

– определение численности основных популяций и субпопуляций лимфоцитов;

– определение концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови.

К тестам II уровня относятся:
– определение субпопуляций регуляторных Т-лимфоцитов;
– тест торможения миграции лейкоцитов с использованием в качестве стимулятора ФГА (фитогемагглютинина);
– оценка пролиферативной активности Т- и В- лимфоцитов на митогены, антигены, аллогенные клетки;
– оценка активности киллерных лимфоцитов;
– выявление циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК);
– определение различных компонентов комплемента;
– оценка различных этапов фагоцитоза и рецепторного аппарата фагоцитов;
– тесты по определению медиаторов иммунной системы, в том числе продукции и рецепции интерлейкинов;
– анализ генов, ответственных за экспрессию иммунологически значимых молекул.

В пособии приведены современные принципы оценки состояния основных звеньев иммунной системы человека для диагностики нарушений иммунной системы при иммунопатологических состояниях. Представлен краткий обзор современных лабораторных методов, используемых в иммунологии. Также охарактеризованы возможности использования иммунологических методов в различных областях клинической медицины.

 

Методы оценки функциональной активности лимфоцитов.

2.2.1.Определение пролиферативной способности лимфоцитов. Ответ лимфоцитов на действие антигенов имеет клональный характер,

поскольку лишь клетки конкретных клонов несут на своей поверхности рецепторы для определенных антигенов. Интенсивное деление лимфоцитов определенных клонов после распознавания ими антигена должно обеспечить эффективный иммунный ответ. Оценка способности лимфоцитов к пролиферативному ответу in vitro в ответ на стимуляцию является важным показателем их функциональной активности. В лабораторных условиях для стимуляции лимфоцитов используют поликлональные стимуляторы – митогены, на них отвечают практически все представители лимфоцитов. Специфичным для Т-клеток является фитогемагглютинин (ФГА) и конканавалин А (КонА). В-клеточным митогеном является митоген лаконоса (МЛ) и липолисахарид (ЛПС).

Для оценки пролиферации используются различные методы – морфологический, радиометрический, цитофлуориметрический. Наиболее распространенным способом оценки пролиферации является оценка включения Н³-тимидина, которая позволяет объективно оценить изменение пролиферативного ответа клеток.

Принцип метода состоит в культивировании лимфоцитов в присутствии митогена с последующим добавлением Н³-тимидина и оценкой его включения в пролиферирующие клетки. Поскольку репликация ДНК – неотъемлимая и обязательная часть процесса пролиферации, считается, что включение Н³-тимидина может служить мерой пролиферации.

Оценка пролиферативного ответа на действие митогенов считается наиболее универсальным тестом для оценки функции лимфоцитов. Отсутствие реакции на митогены свидетельствует о тяжелой недостаточности клеточного иммунитета.

Оценка ГЗТ in vivo.

Кожные пробыпозволяют оценить способность Т-лимфоцитов вызывать реакцию замедленного типа при внутрикожном введении антигена. Размеры эритемы и папулы в месте инъекции определяют через 24 и 48 ч. Поскольку отрицательная реакция может быть следствием не только нарушения иммунитета, но и отсутствия предшествующего контакта с данным антигеном, пробу проводят с набором широко распространенных антигенов, в который входят очищенный туберкулин, столбнячный и дифтерийный анатоксины. Отрицательная реакция на несколько распространенных антигенов у больных с оппортунистическими инфекциями свидетельствует о выраженной недостаточности клеточного иммунитета.

Снижение функциональной активности Т-лимфоцитов приводит к клиническим проявлениям инфекций, вызываемых внутриклеточными бактериями, вирусами, грибами, простейшими (пневмония, вызываемая Pneumocystic carinii, цитомегаловирусная инфекция, токсоплазмоз, криптоспоридиоз и др.); опухолевому росту.

Активация клеточных эффекторных функций может лежать в основе воспаления при аллергии (контактный дерматит) и аутоиммуных заболеваниях (ревматоидный артрит, рассеянный склероз, псориаз).

Заключение.

В заключении следует сказать, что исследование иммунного статуса имеет определяющее значение в диагностике иммуноопосредованных заболеваний. При дальнейшем изучении дисциплины следует обратить внимание на объем иммунологического обследования, необходимый для уточнения диагноза, определения тактики лечения и прогноза при первичных иммунодефицитах, чаще встречающихся в практике врача вторичных иммунодефицитах, а также аутоиммунных и аллергических заболеваниях.

Логично предположить, что возможности использования иммунологических методов в различных областях клинической медицины могут быть расширены в связи с дальнейшим изучением тонких механизмов работы иммунной системы, разработкой новых методических подходов.

 

Вопросы для самоконтроля.

1. Назовите иммунологический метод, используемый для количественного определения популяций и субпопуляций лимфоцитов.

2. Что понимают под иммунным статусом?

3. Перечислите основные дифференцировочные антигены (маркеры) зрелых Т-лимфоцитов, хелперных Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, НК-клеток.

4. Назовите метод, используемый для оценки функциональной активности Т- и В-лимфоцитов.

5. Какие методы используются для количественного определения иммуноглобулинов сыворотки крови (IgG, IgM, IgA)?

6. Назовите иммунологический метод, наиболее часто используемый для определения специфических антител.

7. Какие функции моноцитов и макрофагов можно оценить с помощью лабораторных методов?

8. Какие методы используются для оценки бактерицидности фагоцитов?

9. Что такое НСТ-тест?

10. Функцию каких клеток позволяет оценить метод ГЗТ in vivo?

11. Назовите иммунологические методы, основанные на реакции антиген-антитело.

 

Библиографический список.

1. Аллергология и иммунология: национальное руководство / Под ред. Хаитова Р.М., Ильиной Н.И. – М.: ГОЭТАР-Медиа, 2009. – 656 с. – (Серия «Национальное руководства»).

2. Клиническая иммунология и аллергология / Под ред. Лолора-младшего Г., Фишера Т., Адельмана Д. Пер. с англ. – М.: Практика, 2000. – 806 с.

3. Система цитокинов: Теоретические и клинические аспекты / Под ред. Козлова В.А., Сенникова С.В.. – Новосибирск: Наука, 2004. – 324 с.

4. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний иммунной системы / Руководство для врачей. – М: ГОЭТАР-Медиа, 2009, – 352 с.

5. Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Проточная цитометрия как современный метод анализа в биологии и медицине // Медицинская иммунология, 2007, Т. 9, N 4-5. с. 373-378.

6. Ярилин А.А. Основы иммунологии. – М.: Медицина, 1999. – 607 с.

7. Ярцев М.Н., Яковлева К.П. Иммунная недостаточность: клинико-лабораторная оценка иммунитета у детей // Иммунология, 2005, N 1, с. 36-44.

 

Кафедра клинической иммунологии