Лекция №4. Микробиологические методы исследования.

 

Объект изучения медицинских микробиологических лабораторий — патогенные биологические агенты (ПБА) — патогенные для человека микроорганизмы (вирусы, бактерии, грибы, простейшие), генно-инженерно модифицированные микроорганизмы, яды биологического происхождения (токсины), гельминты, а также материал (включая кровь, биологические жидкости и экскременты организма человека), подозрительный на содержание ПБА.

В зависимости от выполняемых исследований, микробиологические лаборатории подразделяют на диагностические, производственные и научно-исследовательские. В соответствии с типами микроорганизмов, изучаемых в микробиологических лабораториях, выделяют:

бактериологические,

вирусологические,

микологические и

протозоологические лаборатории.

С возбудителями инфекционных заболеваний работают только в специализированных микробиологических лабораториях, обеспечивающих безопасность её персонала и невозможность «утечки» патогенных микроорганизмов за пределы лаборатории.

Регламентация условий работы с возбудителями инфекционных заболеваний произведена в соответствии со степенью опасности микроорганизмов для человека. По этому признаку выделено четыре группы возбудителей инфекционных заболеваний.

Группа I возбудителей инфекционных заболеваний: возбудители особо опасных инфекций: чума, натуральная оспа, лихорадки Ласса, Эбола и др.

Группа II возбудителей инфекционных заболеваний: возбудители высококонтагиозных бактериальных грибковых и вирусных инфекций: сибирская язва, холера, лихорадка Скалистых гор, сыпной тиф, бластомикоз, бешенство и др. В эту группу также включён ботулотоксин (но не сам возбудитель ботулизма).

Группа III возбудителей инфекционных заболеваний: возбудители бактериальных грибковых, вирусных и протозойных инфекций, выделенных в отдельные нозологические формы (возбудители коклюша, столбняка, ботулизма, туберкулёза, кандидоза, малярии, лейшманиоза, гриппа, полиомиелита и др.). В эту группу также включены аттенуированные штаммы бактерий групп I, II и III.

Группа IV возбудителей инфекционных заболеваний: возбудители бактериальных, вирусных, грибковых септицемии, менингитов, пневмоний, энтеритов, токсикоинфекций и острых отравлений (возбудители анаэробных газовых инфекций, синегнойной инфекции, аспергиллеза, амебиаза, аденовирусы, герпесвирусы и др.)

В зависимости от уровня безопасности работы с микроорганизмами микробиологические лаборатории подразделяют на четыре группы риска.

Первая группа риска микробиологических лабораторий: лаборатории особого режима (максимально изолированные) с высоким индивидуальным и общественным риском.

Вторая группа риска микробиологических лабораторий: режимные лаборатории (изолированные) с высоким индивидуальным и низким общественным риском.

Третья группа риска микробиологических лабораторий: базовые (основные) лаборатории с умеренным индивидуальным и ограниченным общественным риском.

Четвёртая группа риска микробиологических лабораторий: базовые (основные) лаборатории с низким индивидуальным и общественным риском.

В системе Министерства здравоохранения и Государственного комитета санитарно-эпидемиологического надзора РФ наиболее разветвлена сеть бактериологических лабораторий. В соответствии с выполняемыми задачами выделяют;

• бактериологические лаборатории в составе ЛПУ;

• бактериологические лаборатории в составе комитетов Госсанэпиднадзора;

• учебные бактериологические лаборатории вузов;

• проблемные и отраслевые бактериологические лаборатории научно-исследовательских институтов и предприятий по выпуску бактерийных препаратов;

• специализированные бактериологические лаборатории по контролю за особо опасными инфекциями;

• специализированные бактериологические лаборатории по контролю за отдельными группами бактерий: микобактериями, риккетсиями, лептоспирами и др. Большая часть микробиологических лабораторий работает с ПБА групп III и IV, а изучением возбудителей особо опасных инфекций (группы I и II) занимаются только специализированные лаборатории.

Работу с патогенными биологическими агентами (ПБА) групп III и IV выполняют специалисты с высшим и средним специальным образованием. К ней допускают сотрудников, прошедших инструктаж по соблюдению требований безопасности работы с ПБА; последующий инструктаж следует проводить не реже одного раза в год. Все сотрудники, работающие с патогенными биологическими агентами (ПБА), должны находиться на диспансерном учёте. Приборы, оборудование и средства измерения должны быть аттестованы, технически исправны и иметь технический паспорт. Их метрологический контроль и техническое освидетельствование следует проводить в установленные сроки.

Из правил работы в грязной зоне базовой микробиологической лаборатории: П еред работой в микробиологической лаборатории следует проверить качество посуды, пипеток, шприцев и другого оборудования. При пипетировании необходимо пользоваться только резиновыми грушами или автоматическими устройствами. Строго запрещено пипетировать материал ртом, переливать его через край сосуда (пробирки, колбы), а также оставлять без надзора рабочее место во время выполнения любых работ с патогенными биологическими агентами (ПБА). В грязной зоне микробиологической лаборатории запрещается курить, пить воду, хранить верхнюю одежду, головные уборы, обувь, пищевые продукты. В помещения зоны нельзя приводить детей и домашних животных. Окончание работы в микробиологической лаборатории После окончания работы в микробиологической лаборатории все объекты, содержащие ПБА, должны быть убраны в хранилища (холодильники, термостаты, шкафы) с обязательной дезинфекцией столов. Использованные пипетки полностью (вертикально) погружают в дезинфицирующий раствор, избегая образования пузырьков в каналах. Остатки ПБА, использованную посуду и оборудование собирают в закрывающиеся ёмкости и передают в автоклавную. Категорически запрещено сливать отходы с патогенными биологическими агентами (ПБА) в канализацию без предварительного обеззараживания. После окончания работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) и заражёнными животными, а также после ухода из лаборатории следует тщательно вымыть руки.

Цель микробиологических исследований — установить факт наличия или отсутствия возбудителя в организме больного и на объектах окружающей среды (индефецировать)

Задачи микробиологических исследований — идентифицировать микроорганизмы в исследуемом материале, определить их видовую принадлежность, морфологические, биохимические, токсигенные и антигенные свойства, а также установить чувствительность выделенных микроорганизмов к антимикробным препаратам. Несмотря на то что проведение микробиологических исследований относится к компетенции микробиологов, каждый медицинский работник, имеющий дело с инфекционными заболеваниями, должен знать, как и когда необходимо отбирать материал для исследований, на какие исследования его направлять и как интерпретировать полученные результаты.

Первый этап любого микробиологического исследования составляет правильный выбор материала для исследования. Его определяют свойства возбудителя и патогенез вызываемого им заболевания. При поражениях отдельных органов и систем целесообразно отбирать материал соответствующей локализации. При отсутствии поражений исследуют кровь, а затем отбирают образцы с учётом клинической картины заболевания и доступности материала для исследования. Так, при лихорадке неясного генеза первоначально проводят посев крови; затем, при появлении симптомов более конкретных проявлений, например пневмонии, проводят забор мокроты.

• Образцы материала для микробиологического исследования следует забирать до назначения антимикробной терапии, с соблюдением правил асептики для предупреждения загрязнения материала. Каждый образец следует рассматривать как потенциально опасный. При заборе, транспортировке, хранении и работе с ним необходимо соблюдать правила биологической безопасности. Материал собирают в объёме, достаточном для всего комплекса исследований. Микробиологические исследования следует начинать немедленно после поступления образца в лабораторию.

• Выбор материала для микробиологического исследования должен соответствовать характеру инфекционного процесса. Так, например, при установлении этиологии пневмонии материалом должна быть мокрота, а не слюна, а при раневых инфекциях отделяемое следует забирать из глубины раны, а не с её поверхности.

Виды микробиологических исследований.

Основу микробиологической диагностики инфекционных заболеваний составляют микроскопические, микробиологические, биологические, серологические и аллергологические методы.

Микроскопические методы исследований включают приготовление мазков и препаратов для микроскопирования. В большинстве случаев результаты микроскопических исследований носят ориентировочный характер (например, определяют отношение возбудителей к окраске), так как многие микроорганизмы лишены морфологических и тинкториальных (особенности окрашивания) особенностей. Тем не менее микроскопией материала можно определить некоторые морфологические признаки возбудителей (наличие ядер, жгутиков, внутриклеточных включений и т.д.), а также установить факт наличия или отсутствия микроорганизмов в присланных образцах.

Микробиологические методы исследований — «золотой стандарт» микробиологической диагностики, так как результаты микробиологических исследований позволяют точно установить факт наличия возбудителя в исследуемом материале. Идентификацию чистых культур (до вида микроорганизма) проводят с учётом морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, токситенных и антигенных свойств микроорганизма. Большинство исследований включает определение чувствительности к антимикробным препаратам у выделенного возбудителя. Для эпидемиологической оценки роли микроорганизма проводят внутривидовую идентификацию определением фаговаров, биоваров, резистентваров и т.д.

Биологические методы исследований направлены на определение наличия токсинов возбудителя в исследуемом материале и на обнаружение возбудителя (особенно при незначительном исходном содержании в исследуемом образце). Методы включают заражение лабораторных животных исследуемым материалом с последующим выделением чистой культуры патогена либо установлением факта присутствия микробного токсина и его природы. Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных животных — важный инструмент изучения патогенеза заболевания и характера взаимодействий внутри системы микроорганизм-макроорганизм. Для проведения биологических проб используют только здоровых животных определённых массы тела и возраста. Инфекционный материал вводят внутрь, в дыхательные пути, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно и подкожно, в переднюю камеру глаза, через трепанационное отверстие черепа, субокципитально (в большую цистерну головного мозга). У животных прижизненно забирают кровь, экссудат из брюшины, после гибели — кровь, кусочки различных органов, СМЖ, экссудат из различных полостей.

Серологические методы исследований выявления специфических AT и Аг возбудителя — важный инструмент в диагностике инфекционных заболеваний. Особую ценность они имеют в тех случаях, когда выделить возбудитель не представляется возможным. При этом необходимо выявить повышение титров AT, в связи с чем исследуют парные образцы сыворотки, взятые в интервале 10-20 сут (иногда этот интервал может быть более длительным). AT обычно появляются в крови на 1-2-ю неделю заболевания и циркулируют в организме относительно долго, что позволяет использовать их выявление для ретроспективных эпидемиологических исследований. Определение классов Ig чётко характеризует этапы инфекционного процесса, а также может служить косвенным прогностическим критерием, Особое значение имеют методы выявления микробных Аг. В значимых количествах они появляются уже на самых ранних сроках, что делает их идентификацию важным инструментом экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, а количественное их определение в динамике инфекционного процесса служит критерием эффективности проводимой антимикробной терапии.

Аллергологические методы исследования Антигены многих возбудителей обладают сенсибилизирующим действием, что используют для диагностики инфекционных заболеваний, а также при проведении эпидемиологических исследований. Наибольшее распространение нашли кожно-аллергические пробы, включающие внутри-кожное введение Аг (аллергена) с развитием реакции ГЗТ. Кожные пробы нашли применение в диагностике таких заболеваний как сап, мелиоидоз, бруцеллёз. Наиболее известна проба Манту, используемая как для диагностики туберкулёза, так и для оценки невосприимчивости организма к возбудителю.