Методы исследования в микробиологии

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В МИКРОБИОЛОГИИ

Минск БГМУ 2010

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

Белорусский государственный медицинский университет

Кафедра микробиологии, вирусологии, иммунологии

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В МИКРОБИОЛОГИИ

Учебно-методическое пособие

Минск БГМУ 2010

УДК

ББК

С

Рекомендовано Научно-методическим советом университета

в качестве учебно-методического пособия 24.03.2010 г., протокол № 8

Авторы: канд. мед. наук, доцент Ж. Г. Шабан; канд. мед. наук, доцент В. В. Слизень; канд. мед. наук, доцент Т. А. Канашкова; канд. мед. наук, доцент И. А. Крылов

Рецензенты: зав. кафедрой биологии Белорусского государственного медицинского университета канд. мед. наук, доцент Э. В. Бутвиловский; доцент кафедры эпидемиологии Белорусского государственного медицинского университета канд. мед. наук А. М. Близнюк

Методы исследования в микробиологии: учеб.-метод. пособие/ Ж.Г. Шабан [и др.]. С – Минск: БГМУ, 2010. – с.

 

ISBN

 

Посвящено посвящено особенностям применения современных микробиологических методов исследования. Описаны виды биоматериалов и методы их забора для микробиологических исследований, техника выполнения методов, приведены критерии интерпретации результатов, контроль качества и стандартизация процедур, указаны преимущества и недостатки методов, изложены вопросы организации проведения микробиологического исследования.

Предназначено для студентов всех факультетов.

УДК

ББК

Учебное издание

 

Шабан Жанна Георгиевна

Слизень Вероника Вячеславовна

Канашкова Татьяна Александровна

Крылов Игорь Александрович

 

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В МИКРОБИОЛОГИИ

Учебно-методическое пособие

Ответственная за выпуск Т. А. Канашкова

В авторской редакции

Компьютерная вёрстка Н. М. Федорцовой

Корректор Ю. В. Киселёва

 

Подписано в печать 25.03.10. Формат. Бумага писчая «Снегурочка».

Печать офсетная. Гарнитура «Times».

Усл. печ. л. Уч.-изд. л. Тираж 75 экз. Заказ.

Издатель и полиграфическое исполнение:

учреждение образования «Белорусский государственный медицинский университ».

ЛИ №

ЛИ №

Ул. Ленинградская, 6, 20006, г. Минск.

 

ISBN Оформление. Белорусский государственный

медицинский университет, 2010

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Аг – антиген

АЛМИ – аллергологический метод исследования

Ат – антитело

БЛМИ – бактериологический метод исследования

БСМИ – бактериоскопический метод исследования

ВИЧ - вирус иммунодефицита человекка

ГЗТ – гиперчувствительность замедленного типа

ГНТ – гиперчувствительность немедленного типа

ИФА - иммуноферментный анализ

КОЕ - колониеобразующая единица

МБК - минимальная бактерицидная концентрация

МИК - минимальная ингибирующая (подавляющая) концентрация

п. о. – пара олигонуклеотидов

ПДАФ - полиморфизм длины амплифицированных фрагментов

ПП-ПЦР - полимеразная цепная реакция с использованием произвольных праймеров

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

РА – реакция агглютинации

РИА – радиоиммунный анализ

РИФ - реакция иммунофлюоресценции

РН – реакция нейтрализации

РП – реакция преципитации

РПГА – реакция пассивной гемагглютинации

РСК – реакция связывания комплемента

РТГА – реакция торможения гемагглютинации

РТГАдс – реакция торможения гемадсорбции

СЛМИ – серологический метод исследования

УПМ – условно-патогенные микроорганизмы

ЭМ – электронная микроскопия

ЭСМИ – экспериментальный метод исследования

 

ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ

ПРИ РАБОТЕ С БИОЛОГИЧЕСКИМ МАТЕРИАЛОМ

Биологическую опасность, или риск для здоровья людей и окружающей среды,могут представлять инфицированныеорганизмы или биологический материал, содержащий микроорганизмы или токсины биологического происхождения.

Биологическая безопасность – порядок осуществления лабораторных исследований и специальное оснащение микробиологических лабораторий, которые защищают персонал лабораторий и окружающую среду при работе с потенциально инфекционными микроорганизмами.

Уровень биобезопасности – уровень мер предосторожности, необходимых при работе с потенциально опасными биологическими агентами. Различают 4 уровня биобезопасности (табл. 1). В зарубежных странах более высокий номер уровня биобезопасности означает возрастающий риск при выполнении лабораторных исследований.

Таблица 1

ЗАБОР, ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВКА МАТЕРИАЛА

Неприемлемыми для анаэробного культивирования являются пробы, отобранные тампонами, собранные с поверхности кожи и слизистых, с поверхности ран, отхаркиваемая мокрота, моча, выделения из половых органов, желудочное и кишечное содержимое.

Для транспортировки исследуемого материала используют транспортные среды, предотвращающие токсическое действие кислорода (Amies, Cary&Blair, Stuart).

МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ (БСМИ)

БСМИ - совокупность способов обнаружения и изучения морфологических и тинкториальных (способность окрашиваться) свойств микробов в исследуемом материале (лабораторная культура, патологический материал, пробы из внешней среды) с помощью микроскопии.

Цели БСМИ.

1. Установление этиологии заболевания.

2. Определение чистоты выделенной культуры.

Этапы БСМИ (всего 4 этапа).

При использовании сухого объектива с большим фокусными расстоянием световые лучи, идущие от зеркала через конденсор в объектив, проходят через неоднородные среды, различающиеся показателями преломления. Часть лучей отклоняется и не попадает в объектив. В результате поле зрения освещено недостаточно. Обычная световая микроскопия с сухим объективом, имеющим слабое увеличение, в микробиологии используется редко – для изучения микроорганизмов, имеющих крупные размеры (более 10 мкм).

Чтобы увеличить разрешающую способность микроскопа и исследовать более мелкие микроорганизмы, используют иммерсионную микроскопию. Иммерсионный объектив с фокусным расстоянием 1,5–3 мм (маркирован «ОИ» («ИО») или «МИ» («ИМ»), имеет кольцевую чёрную или белую черту) погружают в каплю масла (кедрового, персикового, при их отсутствии – вазелинового), показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла.

Иммерсионное масло устраняет потери попадающих в объектив лучей

света вследствие своего одинакового со стеклом коэффициента преломления (рис. 3). В этом случае падающий на препарат пучок света не рассеивается и, не меняя направления, попадает в иммерсионный объектив; разрешающая способность микроскопа увеличивается.

Иногда вторую каплю иммерсионной жидкости помещают на верхнюю линзу конденсора. В редких случаях используют водную иммерсию, в этом случае устанавливают объектив «ВИ».

Рис. 3. Схема хода лучей в сухой и иммерсионной системах

Увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. Сухие объективы могут иметь увеличение 8, 10, 20, 40, иммерсионные – 90, 100. Окуляры могут иметь увеличение 7, 10, 12, 15. Обычный световой микроскоп даёт увеличение в 100–400 раз, иммерсионный – в 1000 раз.

Качество микроскопа зависит не от степени увеличения, а от его разрешающей способности – минимального расстояния между двумя точками, которое ещё можно различить. Невооружённый человеческий глаз имеет разрешающую способность около 100 мкм. Разрешающая способность светового микроскопа ограничена длиной световых волн. В световых микроскопах с иммерсионной системой при использовании видимой части дневного света можно рассмотреть объекты около 0,2 мкм. Размеры микроорганизмов, имеющих клеточное строение, составляют 0,2–20 мкм (чаще 0,5–10 мкм) и они легко обнаруживаются в иммерсионном микроскопе.

Структуру препарата можно различить лишь тогда, когда разные его частицы по-разному поглощают или отражают свет либо отличаются одна от другой (или от окружающей среды) показателем преломления. Эти свойства обусловливают контрастность изображения – различие яркостей изображения и фона. Если это различие составляет менее 3–4 %, то его невозможно уловить.

 

Другие методы световой микроскопиивыбираются в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов.

Темнопольная микроскопия (ТПМ) – микроскопия с боковым освещением (ультрамикроскопия), позволяет обнаружить частицы размером в несколько миллимикронов, которые не видны в светлопольном микроскопе.

Принцип ТПМ. Микроскопия в тёмном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля).

Эффект тёмного поля создаётся с помощью специального темнопольного конденсора, имеющего боковую зеркальную поверхность или обычного конденсора, между линзами которого вкладывают кружок чёрной фотобумаги так, чтобы незначительная периферическая часть линзы оставалась свободной.

При выходе из темнопольного конденсора основная часть лучей света не попадает в объектив. Изображение в микроскопе формируется при помощи небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата и прошедшими через объектив (рис. 4).

Рис. 4. Ход лучей в темнопольном микроскопе

 

При микроскопии препарата в тёмном поле зрения на верхнюю линзу конденсора наносят каплю масла, помещают препарат с предметным стеклом, на которое наносят каплю масла. Наносить масло на обе поверхности необходимо, чтобы при иммерсионной микроскопии проходящие лучи света не преломлялись. Можно использовать и сухую систему (объектив х40) и помещать каплю масла только на верхнюю линзу конденсора. Так как для бокового освещения необходим параллельный пучок света, применяется только плоское зеркало. Вместо масла можно использовать дистиллированную воду.

В темнопольном микроскопе в нативных препаратах изучают живых неокрашенных микроорганизмов, напр., спирохет (рис. 5).

Прямые лучи освещают объект не снизу, а сбоку и не попадают в глаза наблюдателя. В объектив попадают лучи, отражённые исследуемым объектом. Неосвещённое поле зрения остаётся совершенно тёмным, а микроорганизмы, отражающие лучи света, выглядят ярко светящимися.

Рис. 5. Treponema pallidum в темнопольном микроскопе

Фазовоконтрастная (ФКМ) микроскопия позволяет исследовать нативные препараты: бесцветные, прозрачные объекты, детали строения которых оптически мало различаются (живые клетки, срезы тканей, микоплазмы).

При ФКМ используют дополнительное фазово-контрастное устройство, состоящее из фазового объектива и фазового конденсора.

Фазовый объектив внутри имеет фазовую пластинку с нанесенным кольцом, которое изменяет фазу и уменьшает амплитуду световой волны. Середина кольца составляет 1/2–2/3 от диаметра выходного зрачка объектива, светопропускание кольца – 10–30% в зависимости от типа фазового контраста.

Фазовый конденсор имеет кольцевую диафрагму с прозрачным световым кольцом. Размер светового кольца подбирается так, чтобы он соответствовал (или был чуть меньше) размеру фазового кольца объектива.

Изображение кольцевой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пластинки соответствующего объектива.

Принцип ФКМ. Человеческий глаз хорошо определяет изменения интенсивности света, наступающие при прохождении через окрашенные препараты, когда меняется амплитуда колебаний света. Распространение же световых волн в прозрачных однородных объектах не сопровождается потерей интенсивности света. Меняется только скорость прохождения света через объект по сравнению со скоростью его распространения в окружающей среде. Эти изменения называются фазовыми, так как при этом изменяется фаза колебаний прошедшего света. Фазовые колебания света глаз не воспринимает, а наблюдаемые объекты выглядят малоконтрастными, прозрачными.

Пучок света, проходя через кольцевую щель диафрагмы и объект, попадает в кольцо фазовой пластинки объектива. Лучи света отклоняются от фазовой пластинки (рис. 6). В результате между лучами, прошедшими через объект, и лучами светового фона возникает разность длины волны.

Таким образом, при использовании фазово-контрастного устройства невидимые фазовые изменения преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения интенсивности (яркости) света, которые различимы глазом.

Рис. 6. Ход лучей в фазово-контрастном микроскопе

Получаемое изображение называется фазово-контрастным.

В зависимости от способа получения фазовых колец различают 2 типа фазового контраста:

а) позитивный фазовый контраст, когда фазовое кольцо в объективе технологически получается путем травления, что вносит «опережение» в прямо прошедший свет.

При этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, получается темнее на более светлом фоне (рис. 7). Лучшие результаты наблюдаются при позитивном фазовом контрасте.

Рис. 7. Фазово-контрастная микроскопия Bacillus cereus (позитивный фазовый контраст)

б) негативный (аноптральный) фазовый контраст, когда фазовое кольцо в объективе технологически получается путем нанесения на поверхность стекла тонкой пленки из копоти или меди, поглощающей не менее 10% света. Это вносит «запаздывание» в прямо прошедший свет. При этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, выглядит светлее окружающего темного фона. Аноптральная микроскопия позволяет достичь большей чёткости изображения малоконтрастных живых микроорганизмов.

ФКМпозволяет получить изображения малых прозрачных и бесцветных живых объектов (микроорганизмов, клеток).

Крупные прозрачные объекты рассеивают лучи света на небольшие углы, эти лучи проходят вместе с не отклонёнными через фазовое кольцо. Для крупных объектов фазово-контрастный эффект имеет место только вблизи их контуров, где происходит сильное рассеяние.

Люминесцентная микроскопия. Ее п ринцип основан на использовании явления люминесценции (флюоресценции, холодного свечения) – способности некоторых веществ флюоресцировать, т. е. на доли секунд поглощать падающие на них УФ или коротковолновые (сине-фиолетовые) лучи, а затем снова испускать свет. Испускаемый свет имеет длину волны, превышающую длину волны поглощаемого света на 20–50 нм, т. е. смещен по длине волны в сторону длинноволновой области спектра. Так, например, если поглощается синий свет, то испускается зеленый свет. Зеленый свет преобразуется в желтый, желтый – в красно-оранжевый, а невидимое УФ- излучение – в видимый свет. Такое явление носит название «эффект Стокса».

Первичная (собственная) люминесценция наблюдает­ся без предварительного окрашивания объекта. Вторичная (наведенная) возникает после окраски препаратов специаль­ными люминесцирующими красителями – флюорохромами (акридиновым оранжевым – используют для обнаружения гонококков, аурамином – микобактерий, корифосфином – коринебактерий, ФИТЦ (флюоресцеина изотиоцианатом) – для метки антител).

Основной частью люминесцентного микроскопа является осветитель, имеющий лампу ультрафиолетового цвета, и систему фильтров (рис. 8).

Рис. 8. Схематическое изображение люминесцентного микроскопа

Галогенные лампы непригодны в качестве источника света для люминесцентных исследований, так как металлическая нить накаливания преобразует большую часть потребленной электроэнергии в красный или невидимый инфракрасный свет. При этом лампа имеет непрерывный спектр излучения в широком спектральном диапазоне, непригодный для наблюдения слабосветящихся объектов.

Для работы в свете люминесценции необходим источник света с линейчатым спектром, интенсивным в коротковолновой части. Таким спектром излучения обладают ртутные лампы, работающие по принципу газового разряда. Лампы имеют специфичное светящееся тело. В кварцевую колбу вплавлены два электрода. В зоне горения содержится небольшое количество ртути. За счет разрядов определенной мощности высокого напряжения между электродами возникает электрическая световая дуга, которая поддерживается в «горящем» состоянии.

Ртутная лампа излучает интенсивный свет, содержащий значительную долю УФ-излучения, которое необходимо для наблюдения в свете люминесценции.

В оптическую схему люминесцентного микроскопа вводят два светофильтра. Между зеркалом микроскопа и источником света устанавливают сине-фиолетовый светофильтр. Он пропускает от источника-осветителя только сине-зелёный свет, возбуждающий люминесценцию. Вещества-флюорохромы поглощают падающие на них коротковолновые лучи, переходят в возбуждённое состояние и приобретают иной цвет. Обратный переход в нормальное состояние происходит с испусканием света с большей длиной волны. Сине-зелёный свет мешает видеть возбуждаемое им свечение препарата, поэтому по пути к глазу наблюдателя отсекается жёлтым светофильтром.

Люминесцирующие объекты светятся ярким светом в тёмном поле зрения (рис. 9, 10). Сила их света чаще невелика, поэтому люминесцентную микроскопию проводят в затемнённом помещении.

Рис. 9. Micobacterium tuberculosis (желтые) в люминесцентном микроскопе

Рис. 10. Escherichia coli (синие – живые, красные – погибшие) в люминесцентном микроскопе

Преимущества люминесцентной микроскопии:

· цветное светящееся изображение микроорганизмов на чёрном фоне;

· обнаружение и установление локализации и концентрации живых и погибших микроорганизмов;

· возможность обнаружения микроорганизмов в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой степени контрастности изображения;

· при использовании коротких УФ лучей разрешающая способность люминесцентного микроскопа увеличивается до 0,1мкм;

· экспресс-идентификация антигенов микроорганизмов в РИФ;

· возможность исследования прозрачных и непрозрачных объектов;

· возможность исследования жизненных процессов в динамике;

· использование люминесцентной микроскопии при цитологических и гистохимических исследованиях, так как флюорохромы могут распределяться в клетке диффузно либо избирательно окрашивать отдельные клеточные структуры или определенные химические соединения биологического объекта.

Возможности оптических микроскопов ограничены слишком большой длиной волны видимого света (6000 А). Объекты, размеры которых меньше этой величины, находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа и могут быть обнаружены только при электронной микроскопии.

Электронная микроскопия (ЭМ) предполагает использование электронного микроскопа (рис. 11), в котором для освещения объектов вместо светового пучка используются электронные лучи (поток электронов).

Целые клетки из-за своей большой толщины непрозрачны для пучка электронов. Поэтому ЭМ требует специальной подготовки объектов исследования. Материал после фиксации обезвоживают, заливают в эпоксидные смолы, режут стеклянными или алмазными ножами на специальных ультратомах, позволяющих получать ультратонкие срезы толщиной 30–50 нм.

Биологические объекты состоят из веществ, построенных из лёгких элементов (С, N, О, Н, Р, S), поэтому их изображение в электронном микроскопе слабо контрастно и в клетках можно увидеть очень мало структурных деталей. Чтобы сделать изображение более контрастным, клетки обрабатывают электронными красителями – солями тяжёлых металлов (свинца, ртути, хрома, урана, вольфрама). Так как атомы тяжёлых металлов очень сильно рассеивают электроны, то структуры клетки, поглотившие эти металлы, будут выглядеть тёмными и контрастными. В качестве индикаторов для окислительно-восстановительных ферментов в ЭМ используют теллурит калия или соли тетразолия. Эти соединения, проникая в клетки, акцептируют электроны, которые они получают от дегидрогеназ. В результате реакции эти соединения восстанавливаются и выпадают в осадок, имеющий вид электронно-плотных (тёмных на экране микроскопа) зёрнышек, глыбок, слоёв.

Таблица 3

Этап БСМИ. Заключение.

Оценка БСМИ.

Достоинства:

· простой;

· доступный;

· быстрый;

· экономичный.

Недостатки:

· низкая чувствительность световых микроскопов (около 10⁴-10⁵ микроорганизмов в мл), поэтому информативность БСМИ невелика;

· низкая специфичность из-за схожести морфологии микроорганизмов разных видов, поэтому результаты его могут использоваться как ориентировочные при индикации высоких таксонов;

· обычно, как самостоятельный метод, БСМИ – поздний метод исследования, так как для накопления концентрации микроорганизмов, улавливаемой БСМИ, необходимо время; в то же время БСМИ используется на всех этапах БЛМИ для контроля чистоты выделяемой культуры.

Таблица 4

НА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ

Облигатные внутриклеточные паразиты (хламидии, риккетсии, вирусы) культивируются исключительно в клеточных системах: на культурах клеток, в куриных эмбрионах, в организмах чувствительных лабораторных животных. Культивирование же бактерий (накопление микробной биомассы) осуществляется на питательных средах.

Питательная среда - субстрат для выращивания бактерий в лабораторных или производственных условиях.

Требования к питательным средам. В питательных средах создают необходимые условия для роста и размножения бактерий. Питательные среды должны:

· содержать все элементы, из которых строится бактериальная клетка, в такой форме, в которой микроорганизмы способны их усваивать; среды должны содержать источники C и N, минеральные соли, в ряде случаев ростовые факторы (аминокислоты, пурины, пиримидины, витамины);

· быть влажными, чтобы процесс диффузии питательных веществ в клетку проходил без затруднений;

· быть прозрачными (жидкие среды), чтобы можно было визуально наблюдать за ростом микроорганизмов;

· быть стерильными, чтобы знать какому микробу принадлежат те или иные свойства;

· быть изоосмотичными (за счет 0,85% NaCl);

· иметь определённое значение pH и обладать буферными свойствами.

Большинство патогенных бактерий, адаптированных к относительно стабильному микроокружению организма человека, растут преимущественно при близких к нейтральному значению рН 6,5-7,6. Холерный вибрион способен расти на средах с щелочным рН 8,0-9,0 (щелочная пептонная вода, щелочной агар), а грибы микромицеты растут на средах с кислым рН 4,0-6,0 (среда Сабуро). Сапрофиты адаптированы к росту в более широком диапазоне рН 2,0-9,0. Величина рН среды влияет на метаболизм бактерий, воздействуя на растворимость питательных веществ. В процессе роста микроорганизмов величина рН среды может резко меняться, что требует поддержания определённого рН особенно для тех микроорганизмов, которые продуцируют кислоты, но не обладают к ним толерантностью (лактобациллы, энтеробактерии). Для этого в состав среды вводят либо несбраживаемые веще­ства (неорганические фосфаты, карбонат кальция или бикарбонат натрия), либо буферы (фосфатный, трис-солянокислый, цитратный и ацетатный).

Классификации питательных сред (табл. 5).

Таблица 5

Этап.

А.Забор, транспортировка, хранение, предварительная обработка материала. Иногда до посева проводят селективную обработку материала с учетом свойств выделяемого микроорганизма. Например, перед исследованием мокроты или другого материала на присутствие кислотустойчивых микобактерий туберкулеза, материал обрабатывают растворами кислот или щелочей.

Б. Посев в среду обогащения (при необходимости).Его проводят, если в исследуемом материале содержится малое количество бактерий, например, при выделении гемокультуры. Для этого кровь, взятую на высоте лихорадки в большом объёме (8–10 мл у взрослых, 4–5 мл у детей) засевают в среду в соотношении 1:10 (для преодоления действия бактерицидных факторов крови); посев инкубируют при температуре 37⁰С 18-24 ч.

В. Микроскопия исследуемого материала. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают его по Граму или другим методом и микроскопируют. Оценивают присутствующую микрофлору, ее количество. В ходе дальнейших исследований должны быть выделены микроорганизмы, присутствовавшие в первичном мазке.

Г. Посев на питательные среды с целью получения изолированных колоний. Производят посев материала петлёй или шпателем методом механического разобщения на чашку с дифференциально-диагностической или селективной средой с целью получения изолированных колоний. После посева чашку перевора­чивают дном кверху (чтобы избежать размазывания колоний капельками конденсационной жидкости), подписывают и помещают в термостат при температуре 37⁰С на 18-24 ч.

Следует помнить, что при посевах и пересевах микробных культур внимание работающего должно быть обращено на соблюдение правил асептики для предупреждения контаминации питательных сред и предупреждения заражения окружающих и самозаражения!

В случае инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, где имеет значение количество присутствующих микроорганизмов в патологическом материале, делают количественный посев материала, для чего предварительного готовят ряд 100-кратных разведений материала (обычно 3 разведения) в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия в пробирках. После чего по 50 мкл каждого разведения высевают на питательные среды в чашках Петри.

Этап.

А. Изучение морфотипов колоний на средах, их микроскопия. Просматривают чашки и отмечают оптимальную питательную среду, скорость роста, характер роста микроорганизмов. Для изучения выбирают изолированные колонии, расположенные по ходу штриха, ближе к центру. Если вырастает несколько типов колоний – каждый исследуется в отдельности. Оценивают признаки колоний (табл. 7). При необходимости чашки с посевамипросматривают через лупу или с помощью микроскопа с объективом малого увеличения и суженной диафрагмой. Изучают тинкториальные свойства отличающихся морфотипов колоний, для этого из части исследуемой колонии готовят мазок, окрашивают по Граму или другими методами, микроскопируют и определяют морфологию чистоту культуры.При необходимости ставят ориентировочную РА на стекле с поливалентными сыворотками.

Б. Накопление чистой культуры. Для накопления чистой культуры изолированные колонии всех морфотипов пересевают в отдельные пробирки со скошенным агаром или какой-либо другой питательной средой и инкубируют в термостате при +37⁰С (такая температура оптимальна для большинства микроорганизмов, но может быть и другой, например, для Campylobacterium spp. – +42⁰C, Candida spp. и Yersinia pestis – +25⁰C).

В качестве среды накопления для энтеробактерий обычно используют среду Клиглера.

Состав среды Клиглера: МПА, 0,1% глюкозы, 1% лактозы, реактив на сероводород (сернокислое железо + тиосульфат натрия + сульфит натрия), индикатор феноловый красный. Изначальный цвет среды малиново-красный, среда «скошена» в пробирках: имеет столбик (2/3) и скошенную поверхность (1/3).

Посев в среду Клиглера производится штрихом по поверхности и уколом в столбик.

Этап.

А. Учет роста на среде накопления, оценка чистоты культуры в мазке по Граму.Отмечают характер роста выделенной чистой культуры. Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследовании окрашенного мазка, приготовленного из такой культуры, в нём в разных полях зрения обнару­живаются морфологически и тинкториально однородные клетки. Однако в случае выраженного плеоморфизма, присущего неко­торым видам бактерий, в мазках из чистой культуры могут встречаться одновременно клетки с различной морфологией.

Если в качестве среды накопления использовали индикаторную среду Клиглера, то оценивают изменения ее цвета в столбике и скошенной части, по которым определяют биохимические свойства: ферментацию глюкозы, лактозы и продукцию сероводорода. При разложении лактозы желтеет скошенная часть среды, при разложении глюкозы – желтеет столбик. При образовании CO₂ в процессе разложения сахаров образуются газовые пузырьки или разрыв столбика. В случае продукции сероводорода отмечается почернение по ходу укола из-за превращении сульфата железа в сульфид железа.

Характер изменения цвета среды Клиглера (рис. 23) объясняется неодинаковой интенсивностью расщепления микроорганизмами азотистых веществ и образования щелочных продуктов в аэробных (на скошенной поверхности) и анаэробных (в столбике) условиях.

В аэробных условиях на скошенной поверхности происходит более интенсивное щелочеобразование, чем в столбике среды. Поэтому при разложении глюкозы, присутствующей в среде в небольшом количестве, образующаяся на скошенной поверхности кислота быстро нейтрализуется. В то же время при разложении лактозы, присутствующей в среде в высокой концентрации, щелочные продукты не способны нейтрализовать кислоту.

В анаэробных условиях в столбике щелочные продукты образуются в ничтожном количестве, поэтому здесь выявляется ферментация глюкозы.

Рис. 23. Индикаторная среда Клиглера:

1 – исходная,

2 – с ростом E. coli,

3– с ростом S. paratyphi B,

4 –с ростом S. typhi

E. coli разлагают глюкозу и лактозу с газообразованием, не продуцируют сероводород. Они вызывают пожелтение столбика и скошенной части с разрывами среды.

S. paratyphi разлагают глюкозу с газообразованием, лактозоотрицательны. Они вызывают пожелтение столбика с разрывами, скошенная часть не изменяет цвет и остается малиновой. При этом S. paratyphi B продуцируют сероводород (по ходу укола появляется черная окраска), S. paratyphi A сероводород не продуцируют.

S. typhi разлагают глюкозу без газообразования, лактозоотрицательны, продуцируют сероводород. Они вызывают пожелтение столбика без разрывов, скошенная часть не изменяет цвет и остается малиновой, по ходу укола появляется черная окраска.

Shigella spp. глюкозопозитивны, лактозоотрицательны, не продуцируют сероводород. Они вызывают пожелтение столбика (с разрывами или без них в зависимости от серовара), скошенная часть не изменяет цвет и остается малиновой.

Б. Окончательная идентификация чистой культуры (определение систематического положения выделенного микроорганизма до уровня вида или варианта) и определение спектра чувствительности выделенной культуры к антибиотикам.

Для идентификации чистой культуры на этом этапе изучают биохимические, генетические, серологические и биологические признаки (табл. 8).

В рутинной лабораторной практике при идентификации нет необходимости изучать все свойства. Используютинформативные, доступные, простые тесты, достаточные для определения видовой (вариантной) принадлежности выделенного микроорганизма.

Таблица 8

Признаки, учитываемые при идентификации микроорганизмов (критерии вида)

Признаки	Характеристика признаков
Морфологические	размеры форма взаимное расположение тинкториальные свойства: окраска по Граму или другими дифференциально-диагностическими методами
Культуральные	рост на плотных(вид колоний)и в жидких средах
Биохимические	выявление ферментов: протеаз (разлагающих белки) карбогидраз (разлагающих углеводы) липаз (разлагающих липиды) оксидоредуктаз (оксидазы, каталазы, дегидраз) ферментов-токсинов(гемолизинов, плазмокоагулазы, лецитиназы, гиалуронидазы,ДНК-азы) экзотоксинов (дифтерийного и др.) профиля летучих жирных кислот (для анаэробов)
Генетические	содержание Г+Ц (%) в ДНК последовательность нуклеотидов в ДНК и РНК
Серологические	изучение антигенной структуры микроба и определение его серовара в РА на стекле с моновалентными сыворотками или в реакции латекс-агглютинации
Биологические	вирулентность для животных токсигенность чувствительность к бактериофагам (определение фаговара) чувствительность к антибиотикам
Экологические	(естественноеместо обитания)

4 этап.

А. Учет и анализ результатов. Учитывают результаты изучения биохимических, серологических, генетических и др. характеристик и сравниваютихсо свойствами эталонных (типовых) штаммов различных видов микроорганизмов. Относят идентифицируемый микроорганизм к тому виду, с которым он проявляет наибольшее сходство. Учитывают спектр чувствительности к противомикробным препаратам.

Б. Выдача заключения. Оформляют заключение, которое представляет собой заверенный бланк с данными о пациенте, исследованном материале, выделенных видах микроорганизмов (в случае выделения УПМ необходимо указывать количество), спектре их чувствительности к противомикробным препаратам.

 

Этап.

Этап.

А. Изучение морфтипов колоний на кровяном анаэробном агаре. Колонии анаэробов слизистые, выпуклые, мелкие, полупрозрачные, с серо-белыми, преимущественно ровными краями. Колонии пигментирующих видов превотелл, порфиромонад, пептококков и пептострептококков приобретают светло-коричневое или черно-коричневое окрашивание на 7-14 сутки инкубации на средах, содержащих кровь. Колонии бактероидов на кровяном агаре могут давать зоны a-гемолиза. Колонии Clostridium perfringens могут обуславливать двойной гемолиз: 1 зона (внутренняя) - b-гемолиз, 2 зона (внешняя) - a-гемолиз. Роящийся рост типичен для C. septicum, C. tetani. C. difficile образуют колонии в виде битого стекла, могут иметь круглую или неправильную форму со слегка волокнистыми краями. Колонии Fusobacterium spp. имеют желтоватый или желто-кремовый оттенок.

Б. Хроматография тиогликолевой среды и индикация анаэробов в среде по наличию летучих жирных кислот.

В. Микроскопия колоний.

Г. Изучение флюоресценции колоний с помощью лампы Вуда. В проходящем длинноволновом УФ-свете (365 нм) представители рода Prevotella дают ярко-красную флюоресценцию, рода Porphyromonas иC. difficile - желто-зеленую флюоресценцию.

Д. Посев изолированных колоний с целью определения их чувствительности к кислороду. Селективные анаэробные среды не всегда эффективно ингибируют рост сопутствующей факультативно-анаэробной микрофлоры, в связи с чем, на втором этапе бактериологического исследования подтверждают чувствительность исследуемой куль