III. Методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была разработана в 1983 г. американским биохимиком Кэри Мюллисом, который в 1993 г. был удостоен за это открытие Нобелевской премии.

Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК и заключается в получении множественных копий (ампликонов) ДНК размером до 5000 п. о.

В качестве амплифицируемых участков ДНК микроорганизмов могут выступать гены патогенности, жизненно важных функций (гены «домашнего хозяйства»), устойчивости к противомикробным препаратам, видо- и родоспецифичные гены (важны для идентификации).

Принцип ПЦР. После температурной денатурации двухцепочечной ДНК образуются одноцепочечные молекулы, к которым присоединяются небольшие олигонуклеотиды – праймеры. Праймеры присоединяются только к комплементарному участку ДНК на обоих цепях ДНК и ограничивают амплифицируемый фрагмент с двух сторон. К 3’концу праймера прикрепляется ДНК-полимераза и на ДНК-матрице синтезирует копию. Синтез ДНК протекает только между праймерами.

Каждая стадия происходит при определенной температуре (рис. 31).

Рис. 31. Схема полимеразной цепной реакции

Каждый вновь синтезируемый фрагмент ДНК служит матрицей для синтеза двух новых нитей в следующем цикле амплификации. При многократном (30-40 раз) повторении этих стадий и оптимальном сочетании компонентов реакционной смеси происходит экспоненциальное увеличение количества ампликонов до 2ⁿ, где n - число циклов амплификации. Детекцию образуемых ампликонов проводят с использованием электрофореза, либо флюоресцирующих зондов, либо флюоресцирующего ДНК-красителя SybrGreen. Получающиеся ампликоны имеют определенный размер, равный количеству олигонуклеотидных пар амплифицируемой последовательности и праймера.

Постановка ПЦР проводится в 5 этапов.

1этап. Выделение (экстракция) ДНК из клеток(рис.32). Метод выделения ДНК зависит от изучаемого микроорганизма и вида материала для исследований.

На этой стадии клетки лизируют одним из способов: а) ферментативно (лизоцим); б) химически; в) термически (90 – 95⁰С). Клеточный дебрис осаждают центрифугированием, при этом ДНК остается в растворе. В некоторых случаях возникает необходимость в концентрировании ДНК. Для этого находящуюся в растворе ДНК адсорбируют на сорбенте, а затем проводят десорбцию ДНК небольшим количеством элюента. Концентрируют ДНК также с использованием осаждающих ДНК веществ, после чего осевшую ДНК ресуспендируют в небольшом объеме воды.

2 этап. Приготовление реакционной смеси. В микроцентрифужных пробирках объемом 0,5 или 0,2 мл смешивают компоненты реакционной смеси так, чтобы объем общей реакционной смеси составлял 25, 50 или 100 мкл. Все компоненты реакции вносят микропипеткой, причём каждый раз наконечник микропипетки меняют во избежание контаминации.

Обязательные компоненты реакционной смеси:

а) раствор искомой ДНК, выделенной на предыдущей стадии;

б) смесь четырёх дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфатов) - строительный материал ДНК;

в) термостабильная ДНК-полимераза - Taq-полимераза (не денатурирует при 96⁰С), осуществляющая полимеризацию нуклеотидов; ее получают из

термофильных микроорганизмов Termophilus aquaticus;

г) два синтетических праймера (прямой и обратный) - короткие, длиной 15 - 30 оснований, одноцепочечные олигонуклеотиды, которые связываются с комплементарными структурами исследуемой ДНК и с которых начинается биосинтез множественных копий;

д) специфический буфер. Для функционирования Taq-полимеразы необходимы ионы Mg⁺², определённые значение рН и концентрации солей.

Необязательным компонентом являются присадки, увеличивающие специфичность реакции.

3. Программирование температурного цикла и проведение амплификации заданного фрагмента ДНК в термоциклере (рис.33). На выделенной ДНК-матрице происходит процесс многократного копирования ДНК в ходе последовательно сменяющихся циклов. Пробирки с реакционной смесью размещают в приборе - термоциклере. Температурные режимы циклов в термоциклере изменяются в соответствии с заданной программой. Программа проведения ПЦР включает 4 стадии (табл. 13).

Таблица 13

Характеристика стадий ПЦР

Стадия	Температура,^0С	Экспо-зиция	Описание стадии
Начальная денатурация	90–95	3–10 мин	Большие двухцепочечные молекулы ДНК раскручиваются с образованием одноцепочечных молекул.
25–40 циклов	денатурация	90–95	25с– 1 мин	Небольшие двухцепочечные ампликоны раскручиваются с образованием одноцепочечных молекул.
отжиг	48–65[i]	25с– 4 мин	Праймеры прикрепляются к комплементарным фрагментам ДНК-матрицы, образуя дуплексы.
элонгация		25с- 4 мин	ДНК полимераза прикрепляется к 3’-концу праймера, соединившегося с ДНК-матрицей, и синтезирует копию, комплементарную ДНК-матрице.
Конечная элонгация		5-10 мин	Образуются дуплексы ДНК.
Хранение		-	-

Примечание. температура отжига зависит от нуклеотидного состава праймера и рассчитывается математически.

4 этап. Визуализация получаемых копий ДНК и регистрация результатов реакции. Образуемый высококонцентрированный раствор ампликонов ДНК прозрачен. Поэтому для выявления ДНК проводят электрофорез в агарозном геле, содержащем флюоресцирующий в УФ-свете ДНК-краситель - бромид этидия. ДНК движется в электрическом поле, взаимодействует с этидием бромидом и при просматривании в трансиллюминаторе (источник УФ света) выглядит в виде светящейся оранжевой полоски. Полученные результаты можно документировать, фотографируя электофореграммы с использованием оранжевого светофильтра.

Проведение электрофореза (рис. 34, 35). Агарозный гель (0,5–4%) с лунками для образцов опускают в аппарат для проведения электрофореза, так чтобы лунки находились в области катода. В камеру для электрофореза заливают трис-ацетат-ЭДТА буфер так, чтобы толщина слоя жидкости над гелем составляла 1-2 мм. Образец смешивают с загрузочным красителем в соотношении 1:6 и вносят 6 – 20 мкл в лунку в геле. Обычно одновременно исследуют много образцов. Загрузочный краситель (зеленый, синий) имеет скорость движения, схожую с ДНК, поэтому по его перемещению судят о местонахождении ДНК в геле. В зависимости от плотности тока время проведения электрофореза составляет от 30 мин до 24 ч. После проведения электрофореза гель вынимают из камеры и переносят на столик трансиллюминатора, где бромистый этидий, связавшийся с ДНК, флюоресцирует в УФ-свете (230 нм), давая оранжевое свечение.

5 этап. Анализ и интерпретация результатов реакции (рис. 36).Для оценки результатов учитывают опытные лунки, а также лунки с положительным и отрицательным контролем (рис. 37, табл. 14).

Рис. 36. Автоматизированная система визуализация гелей –

трансиллюминатор, видеокамера, компьютер

	1 2 3 4 5 Рис. 37. Электрофореграмма продуктов ПЦР при диагностике возбудителя бактериальной инфекции:1- маркер молекулярного веса; 2 - положительный контроль; 3 – результат положительный; 4 - результат отрицательный; 5 – отрицательный контроль     Рис. 24. Электрофореграмма продуктов ПЦР при диагностике возбудителя бактериальной инфекции:1-3 – результат положительный; 4, 5 – результат отрицательный; 6 – отрицательный контроль; 7     – положительный контроль.		Таблица 14 Анализ результатов ПЦР Образцы Светящиеся оранжевые полосы определенной молекулярной массы Отрицательный контроль должны отсутствовать Положительный контроль должны присутствовать Опытные образцы положительные присутствуют Опытные образцы отрицательные отсутствуют

 

При интерпретации результатов ПЦР следует помнить, что могут быть получены как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты.

Ложноположительные результаты могут наблюдаться в результате контаминации при нарушении правил проведения ПЦР. Ложноотрицательные результаты могут наблюдаться в результате снижения чувствительности ПЦР при ингибировании реакции компонентами биологических образцов.

Модификации ПЦР:

1) классическая (specific PCR) - амплификация участков ДНК размером до 5000 п.о. с использованием одной пары праймеров.

2) мультипраймерная (multiplex PCR) – одновременное использование нескольких пар праймеров в одной реакционной пробирке. Это позволяет проводить одновременную амплификацию ДНК различных возбудителей, что сокращает время и расход реактивов. Например, мПЦР для диагностики гнойных менингитов одновременно определяет ДНК наиболее вероятных возбудителей бактериальных менингитов: Neisseria meningitides, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae.

3) широкодиапазонная -использование универсальных праймеров, взаимодействующих с высоко консервативными участками ДНК, встречающимися у многих микроорганизмов. Применяют для выявления в клиническом материале от больного микроорганизмов, в том числе неизвестных и некультивируемых. Обычно мишенью для ПЦР являются гены, кодирующие рибосомы 16S и 23S, имеющие сходную структуру у различных прокариот.

4) с обратной транскрипцией –используется для обнаружения РНК у РНК-вирусов. Первоначально при помощи РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы или ревертазы) синтезируют комплементарную ДНК, которую затем используют в стандартной ПЦР.

5) гнездовая – обладает большей чувствительностью и специфичностью, т. к. проводится последовательно с двумя разными парами праймеров. ДНК продукты, образуемые в первой ПЦР, взаимодействуют со второй парой праймеров.

6) в реальном времени – используетсядля определения точечных мутаций, количественного содержания ДНК в пробе, а также для определения уровня экспрессии генов. Этот тип ПЦР находит все большее распространение, так как выявление ампликонов осуществляется по флюоресценции зондов либо красителя SybrGreen и не требует проведения электрофореза (сокращается время и трудоёмкость анализа).

7) ПП-ПЦР или ПЦР с использованием произвольных праймеров (RAPD-анализ полиморфизма случайно амплифицированной ДНК) – основана на использовании коротких праймеров, длиной 9–10 п. о., способных связаться с разными участками ДНК при низкой температуре отжига. В результате RAPD-анализа происходят амплификации нуклеотидных последовательностей в различных областях генома и образуются многочисленные фрагменты разной длины, по количеству и размерам которых судят о групповой или видовой принадлежности микроорганизма.

8) ассиимметричная – один из праймеров берут в концентрации в 10 раз большей, чем другой, чем добиваются преобладания среди продуктов реакции одноцепочечных ДНК над дуплексами.