II. Этапы БЛМИ при выделении чистой культуры облигатных анаэробов.

Среди облигатных анаэробов выделяют спорообразующие анаэробы клостридии (возбудители ботулизма, столбняка, газовой гангрены) и неспорообразующие (неклостридиальные) - пептококки, пептострептококки, вейлонеллы, пропионобактерии, бактероиды, порфиромонады, превотеллы, фузобактерии.

Этап.

А. Забор материала и транспортировка с использованием транспортных систем для анаэробов.

Б. Микроскопическое исследование материала (в материале присутствуют полиморфные микроорганизмы, либо грубые грамположительные палочки с обрубленными концами).

В. Предварительная обработка материала методами температурного или алкогольного шока для выделения спорообразующих анаэробов.

Процедура алкогольного шока: в течение 1 часа при комнатной температуре (22-25⁰С) при постоянном перемешивании выдерживают смесь равных объемов абсолютного (или 96%) этилового спирта и исследуемого материала (суспензия фекалий, раневой экссудат).

Процедура теплового шока: в подогретую на водяной бане при 80⁰С в течение 5 минут пробирку со средой из рубленого мяса с глюкозой и крахмалом (chopped meat-glucose-starch medium) добавляют 1 мл суспензии соответствующего образца. Экспонируют пробу в течение 10 минут, а затем извлекают пробирку и охлаждают перед посевом в холодной воде.

Г. Посев материла на анаэробный кровяной агар и на элективные, дифференциально-диагностические среды (анаэробный кровяной агар с гентамицином или анаэробный кровяной агар с неомицином и налидиксовой кислотой) с целью получения изолированных колоний. Посевы инкубируют 24-48 часов при 37⁰С в анаэробных условиях (в анаэробной камере, либо в микроанаэростате, либо в анаэробном пакете).

Д. Посев материла в жидкую тиогликолевую среду с целью определения летучих жирных кислот.

Этап.

А. Изучение морфтипов колоний на кровяном анаэробном агаре. Колонии анаэробов слизистые, выпуклые, мелкие, полупрозрачные, с серо-белыми, преимущественно ровными краями. Колонии пигментирующих видов превотелл, порфиромонад, пептококков и пептострептококков приобретают светло-коричневое или черно-коричневое окрашивание на 7-14 сутки инкубации на средах, содержащих кровь. Колонии бактероидов на кровяном агаре могут давать зоны a-гемолиза. Колонии Clostridium perfringens могут обуславливать двойной гемолиз: 1 зона (внутренняя) - b-гемолиз, 2 зона (внешняя) - a-гемолиз. Роящийся рост типичен для C. septicum, C. tetani. C. difficile образуют колонии в виде битого стекла, могут иметь круглую или неправильную форму со слегка волокнистыми краями. Колонии Fusobacterium spp. имеют желтоватый или желто-кремовый оттенок.

Б. Хроматография тиогликолевой среды и индикация анаэробов в среде по наличию летучих жирных кислот.

В. Микроскопия колоний.

Г. Изучение флюоресценции колоний с помощью лампы Вуда. В проходящем длинноволновом УФ-свете (365 нм) представители рода Prevotella дают ярко-красную флюоресценцию, рода Porphyromonas иC. difficile - желто-зеленую флюоресценцию.

Д. Посев изолированных колоний с целью определения их чувствительности к кислороду. Селективные анаэробные среды не всегда эффективно ингибируют рост сопутствующей факультативно-анаэробной микрофлоры, в связи с чем, на втором этапе бактериологического исследования подтверждают чувствительность исследуемой культуры к кислороду. Для этого намеченные для дальнейшего бактериологического исследования колонии высевают параллельно на сектора на две чашки Петри, одну из которых инкубируют в анаэробных условиях, а другую в аэробных (рис. 24).

 

 

········· ············· ·· ···· ··· ··· ··· · · · · · · ·· · · · · ·· · · ·· · · · · · · · · · · ·

 

инкубация в аэробных условиях

1 2     6 3 5 4

	инкубация в анаэробных условиях

 

Рис. 24. Подтверждение чувствительности исследуемой культуры к кислороду

Посев на сектора осуществляют для всех морфотипов колоний; в случае однотипности колоний пересевают не менее пяти колоний. Посев на сектора позволяет также накопить чистые культуры анаэробных микроорганизмов, что важно на дальнейших этапах идентификации и определения чувствительности к антимикробным средствам. Посевы инкубируют 24 – 48 часов при 37⁰с.

3 этап. На третьем этапе исследуют свойства культур, для которых подтверждена чувствительность к кислороду.