Схема экспериментального метода исследования

Цели	1. Выделение и идентификация чистой культуры микроорганизмов.
2. Определение вирулентности и патогенности микроорганизмов.
3. Индикация и идентификация экзотоксинов.
4. Изучение патогенеза инфекционных болезней при воспроизведении экспериментальных инфекций.
5. Производство биологических препаратов.
6. Проверка безвредности и эффективности лечебных препаратов.
7. Лабораторные животные - доноры крови для приготовления кровяных питательных сред.
Этапы	1 - взятие и обработка материала
2 – выбор и заражение лабораторного животного	ü здоровое и чувствительное ü мыши, крысы, кролики, бараны, лошади ü беспородные и линейные ü гнотобионты и гнотофоры
методы заражения: ü накожный ü внутрикожный ü подкожный ü внутримышечный ü внутривенный ü пероральный ü интраназальный ü внутриполостной ü внутриорганный
	прижизненно	ü наблюдение ü взятие материала для БЛМИ и СЛМИ ü постановка кожно-аллергических проб
гибель (умерщвление) животного, вскрытие	ü патологоанатомическая картина ü патоморфологическая картина ü препараты-отпечатки ü взятие материала для БЛМИ и СЛМИ
4 – идентификация и заключение
Оценка	достоинства	ü относительно высокая чувствительность ü высокая специфичность ü ранний метод исследования
недостатки	ü длительность ü не всегда доступен ü опасность инфицирования ü дорогостоящий

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ

СЕРОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА ИССЛЕДОВАНИЯ

Серологический (от лат. serum - сыворотка, logos – учение) метод исследования (СЛМИ) – метод, в основе которого лежит реакция специфического взаимодействия антигенов (Аг) и антител (Ат).

Используя этот метод, можно определить неизвестное Ат при взаимодействии с известным Аг, и наоборот.

Основные понятия.

Диагностическая сыворотка (известное Ат) – иммунная сыворотка, содержащая Ат известной специфичности в известном титре. Диагностические сыворотки получают путём иммунизации животных соответствующим Аг. В последнее время в этом качестве всё чаще используют моноклональные Ат.

Диагностикум (известный Аг) - взвесь в физрастворе известных микроорганизмов или извлечённых из них Аг. В качестве неспецифического диагностикума могут быть использованы перекрёстно реагирующие Аг.

Титр сыворотки – максимальное разведение сыворотки (или минимальное её количество), в котором обнаруживаются Ат.

Диагностический титр – разведение сыворотки, в котором реакция положительна только у больных и отрицательна у здоровых. Для одной инфекции диагностический титр каждой серологической реакции свой.

Парные сыворотки – сыворотки одного обследуемого, взятые с определённым интервалом для изучения динамики титра Ат. Первую сыворотку берут в начале заболевания, в острую стадию, вторую – при острых инфекциях – через 7–14 дней, при хронических инфекциях – через месяц.

Серонегативный период – стадия заболевания, в которой специфические Ат ещё не обнаруживаются, несмотря на наличие возбудителя («серологическое окно»).

Серопозитивный период – стадия заболевания, в которой специфические Ат обнаруживаются.

Сероконверсия – переход серонегативности в серопозитивность.

Задачи СЛМИ:

1) серодиагностика инфекционных заболеваний, основанная на обнаружении в сыворотке Ат; диагностическое значение имеют:

а) обнаружение Ат в диагностическом титре;

б) оценка динамики титра Ат. При установлении свежего случая заболевания диагностическое значение имеет 4-кратное нарастание титра Ат в парных сыворотках. Однако при наличии дополнительных клинических и эпидемиологических данных для установления диагноза достаточно 2-кратного нарастания титра Ат.

в) определение классоспецифичности антител чётко характеризует этапы инфекционного процесса, а также может служить косвенным прогностическим критерием. Так, выявление специфических IgM свидетельствует о свежем случае заболевания (инфекционная реакция). Выявление специфических IgG – анамнестическая реакция: постинфекционная (титр антител выше) или поствакцинальная (титр антител ниже).

2) серодиагностика аутоиммунных заболеваний и аллергических реакции немедленного типа, основанная на обнаружении в сыворотке Ат;

3) серодиагностика заболеваний, основанная на обнаружении Аг в биологических жидкостях или тканях:

а) экспресс-диагностика инфекционных заболеваний при обнаружении Аг микроорганизмов (например, диагностика хламидиозов, микоплазмозов, уреаплазмозов методом РИФ).

Количественное определение Аг микроорганизмов в динамике инфекционного процесса служит критерием эффективности проводимой антимикробной терапии.

б) диагностика опухолей при обнаружении в сыворотке опухолеассоциированных Аг (например, ПСА (простатспецифического Аг) при раке простаты).

4) определение активности гуморального поствакцинального индивидуального или коллективного иммунитета;

5) определение титров диагностических, лечебных и профилактических сывороток;

6) определение групп крови, подбор доноров при пересадке органов, определение гормонов (щитовидной железы, половых);

7) определение фальсификации пищевых продуктов, судмедэкспертиза на основании определения видовой принадлежности антигенов.

Материал для серологического исследования:

1) сыворотки, полученные из венозной крови, взятой в утреннее время, натощак (между последним приемом пищи и взятием крови должно пройти не менее 12 часов). За сутки до взятия крови необходимо исключить жирную пищу и прием алкоголя, за 1 час – курение. Необходимо исключить повышенные психоэмоциональные и физические нагрузки;

2) чистые культуры микроорганизмов, выделенные от больных или из объектов внешней среды;

3) патологический материал от больных (например, соскобы эпителия, пунктаты, биоптаты, секционный материал) для экспресс-обнаружения Аг микроорганизмов.

Оценка СЛМИ.

I. Достоинства СЛМИ:

1) высокая специфичность определяется способностью Аг взаимодействовать только с гомологичными Ат. Самая низкая специфичность – у РА.

2) чувствительность – минимальное количество Аг или Ат, которое выявляет реакция; хотя чувствительность зависит от метода исследования: минимальная – у РА (выявляет 100 мг Ат в 1 л), максимальная – у ИФА и РИА (выявляют до 0,00001 мг Ат в 1 л). В целом чувствительность достаточно высокая, но не абсолютная (95–98% в самых чувствительных реакциях).

3) ранний метод исследования при выявлении Аг, как микробных (обычно в РИФ), так и опухолеассоциированных (обычно в ИФА).

4) возможность проведения ретроспективных эпидемиологических исследований на основании обнаружения Ат. Ат циркулируют в организме относительно долго после контакта организма с возбудителем. Это особенно важно при ретроспективной диагностике субклинических форм заболеваний.

5) быстрота получения результатов. Скорость получения результатовзависит от используемой реакции. Так, при постановке РА на стекле результат может быть получен через 5 минут, при постановке РПГА – через 2 часа, РСК, ИФА, РИА – через 4 часа, РП в геле – через 24 часа.

II. Недостатки СЛМИ:

1) поздний метод исследования при выявлении Ат: при острых инфекционных заболеваниях обнаружение Ат часто бывает ретроспективным потому, что Ат обычно появляются не ранее 7 дня от начала заболевания, а к этому времени острое заболевание может закончиться.

2) наличие ложных результатов:

А. Ложноположительных (ЛПР): острых (сохраняются до 6 месяцев) или хронических (наблюдаются постоянно).

Причины ЛПР:

а) низкое качество используемой тест-системы, её недостаточная специфичность;

б) наличие сопутствующих заболеваний и состояний:

для острых ЛПР:

– изменение гормонального фона (во время менстуации, за 2 недели до родов, в течение 3 недель после родов);

– другие острые инфекции;

– изменения липидного обмена при отравлениях, приёме алкоголя, жирной пищи, некоторых лекарств;

– при обширных травмах (открытые переломы, сотрясение мозга);

– при инфаркте миокарда (лёгкого).

для хронических ЛПР:

– нарушение обмена веществ;

– другие хронические инфекции;

– аллергические и аутоиммунные заболевания;

– хронические интоксикации;

– злокачественные опухоли.

в) технические погрешности в работе лаборанта (перепутывание образцов).