Особенности выделения и культивирования анаэробов.

1. Анаэробы культивируют на специальных питательных средах, которые должны удовлетворять следующим требованиям:

a) соответствовать сложным пищевым потребностям анаэробов и обеспечивать их быстрый рост, поэтому для культивирования анаэробов используют высокопитательные среды, содержащие пептоны (1,5 – 2%), дрожжевой экстракт (0,5%), витамин К, гемин;

б) содержать, при необходимости, стимулирующие добавки: бараньи эритроциты (5%), лошадиную сыворотку (5-10%), твин-80 (0,02%); пируват натрия (0,9%); глюкозу (0,5%); L – аргинин (0,1%);

в) иметь низкий окислительно-восстановительный потенциал, что достигается путем добавления редуцирующих веществ. Редуцирующий агент, связывая свободный кислород среды, снижает Eh среды. В качестве нетоксичных редуцирующих агентов, обеспечивающих восстановительные условия среды, используют цистеина гидрохлорид (0,025%), тиогликолят натрия (0,05%), дитиотрейтол (0,05%). В некоторые среды (Китта-Тароцци) добавляют кусочки тканей паренхиматозных органов (легкие, печень);

д) содержать селективные добавки, что обеспечивает избирательное выделение облигатно анаэробных микроорганизмов. В качестве селективных добавок используют антибиотики аминогликозидного ряда, к которым анаэробы природно устойчивы.

Для выделения облигатно анаэробных микроорганизмов используют следующие среды:

- анаэробный кровяной агар с гентамицином,

- анаэробный кровяной агар с неомицином и налидиксовой кислотой,

- анаэробный кровяной агар с канамицином и ванкомицином,

- фруктозо-циклосерин-цефокситиновую среду (для Clostridium difficile),

- тиогликолевую полужидкую среду,

- среду Китта-Тароцци (жидкая среда с кусочками мяса и вазелиновым маслом на поверхности),

- среду Вильсона-Блера (железо-сульфитный агар). Clostridium spp. растут в глубине столбика этой среды, давая колонии чёрного цвета за счёт восстановления сернокислого натрия в сульфат натрия, который, соединяясь с хлорным железом, образует чёрный осадок сернистого железа.

2. Посевы облигатно анаэробных микроорганизмов культивируют в атмосфере с содержанием кислорода не более 0,1%. Бескислородные условия для культивирования анаэробов создают с использованием анаэробных камер, микроанаэростатов, либо анаэробных пакетов.

а) Анаэробная камера (рис. 21) представляет собой герметичный прозрачный бокс, перчаточный или бесперчаточный. Анаэробные условия в нем достигаются созданием вакуума с последующим заполнением пространства камеры анаэробным газом трехкомпонентным (N₂ (85%– 90%) + CO₂ (5–10%) + Н₂ (5%)) или двухкомпонентным (N₂ + Н₂). Устройство оснащено шлюзом для подачи из агрессивной кислородсодержащей среды во внутреннее пространство камеры образцов и расходных материалов. В камере также есть термостат, устройство для поддержания и контроля влажности, палладиевый катализатор для удаления остаточных количеств кислорода, прибор контроля концентрации кислорода. Анаэробная камера – дорогостоящее оборудование, им оснащаются преимущественно диагностические центры республиканского значения, рефференс-центры. Обеспечивает наивысшее качество анаэробного культивирования. Отличается вместительностью (50–200 чашек Петри), все диагностические исследования выполняются в бескислородной атмосфере.

б) Микроанаэростат (рис. 22) представляет собой цилиндрическую, герметично закрываемую металлическую или пластмассовую емкость объемом 2,5 (3–7) литров, используемую для инкубации посевов в анаэробных условиях.

Бескислородные условия в микроанаэростате создаются одним из двух способов:

1) вакуумзамещением - создают вакуум и заполняют анаэробным газом;

2) химическим связыванием кислорода. Для химического связывания кислорода используют газогенерирующие системы, которые после добавления воды генерируют Н₂ и СО₂. Н₂ связывает в присутствии палладиевого катализатора свободный кислород с образованием воды. Генерируемый СО₂ необходим для стимуляции роста анаэробов, являющихся капнофилами. В последнее время используют системы, связывающие кислород за счет окисления соединений железа. Создание бескислородных условий в микроанаэростатах контролируется индикаторной тест-полоской, импр егнированной метиленовой синью, которая обесцвечивается в случае образования бескислородной атмосферы.

Вместимость микроанаэростатов составляет 10–12 чашек Петри. Все исследования проводят в кислородсодержащей атомосфере, а затем загружают посевы в микроанаэростат, что снижает качество диагностических процедур по сравнению с анаэробной камерой. Кроме того, отсутствует возможность неограниченного наблюдения за посевами в процессе инкубации. Микроанаэростаты используют в малых лабораториях, они позволяют получить удовлетворительные результаты.

в) Анаэробный пакет представляет собой прозрачный, герметично закрываемый пластиковый пакет, рассчитанный на 1–2 чашки Петри. Анаэробные условия в нем создаются химическим связыванием кислорода с безводной реакционной системой. Создание бескислородных условий также контролируется индикаторной тест-полоской, обесцвечивающейся в бескислородной атмосфере. Анаэробные пакеты удобны для транспортировки материала, культур анаэробов, в экстренных случаях, в полевых условиях, а также в лаборатории при малой диагностической нагрузке. Прозрачность полиэтиленовых мешков позволяет легко проводить периодический контроль роста микроорганизмов. Анаэробные пакеты позволяют получить удовлетворительные результаты.

Исторические методы выделения анаэробов, некогда применявшиеся в практике анаэробной диагностики:

Метод Вейнберга. Готовили последовательные разведения материала в изотоническом растворе и высевали их в пробирки с расплавленным и остуженным до 40-45⁰С сахарным агаром или средой Вильсон-Блера. Клостридии росли в виде черных колоний в толще среды.

Метод Виньяля-Вейона. Исследуемым материалом, разведенным в расплавленной и остуженной до 40-45⁰С среде Вильсона–Блера, заполняли капилляры пастеровских пипеток, концы которых запаивали и помещали в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2-3 сут в столбике агара вырастали колонии анаэробов, которые легко изолировали, надломав капилляр выше уровня намеченной колонии. Изолированные колонии извлекали петлёй, пересевали, изучали свойства с целью идентификации.

Химический способ культивирования анаэробов в эксикаторах (метод Аристовского). Посевы исследуемого материала в чашках Петри помещали в эксикатор - стеклянные емкости с притертыми краями крышки. На дно эксикатора вносили химический поглотитель кислорода: гипосульфит натрия или пирогаллол, и углекислый натрий.

Биологический способ культивирования анаэробов (метод Фортнера), или метод совместного культивирования анаэробов и аэробов на плотных питательных средах в запаянных чашках Петри.На поверхность среды в чашках Петри (5% кровяной агар с 1-2% глюкозы), разделенной на две половины желобком,высевали на одной половинекультуру активно поглощающих кислород аэробов (S. marcescens или E. coli), на другой половине – исследуемый материал. Чашки запаивали воском или заклеивали лейкопластырем. Аэробные бактерии быстро использовали кислород в герметически закрытой чашке, что создавало условия для роста анаэробов. Метод позволял выделять некоторые Clostridium spp.