Тема 4. Непрерывное культивирование микроорганизмов

 

Рост клеток и образование продуктов биосинтеза при периодическом культивировании представляют собой процессы, которые заканчиваются после некоторого определенного времени. В 1949 г. Моно модифицировал процесс периодического культивирования посредством непрерывного введения в хорошо перемешиваемую культуру свежей питательной среды при одновременном удалении из системы эквивалентного количества культуральной жидкости с содержащимися в ней микробными клетками и продуктами биосинтеза (отьемно-доливной способ). В непрерывной микробной культуре рост может поддерживаться в течение длительного времени и может быть достигнуто и поддерживаться установившееся состояние, при котором концентрация клеток, удельная скорость роста и окружающая клетки среда (т.е. концентрация питательных веществ и продуктов) не изменяются со временем. Такое состояние является прямой противоположностью росту в периодической культуре, когда условия в культуральной среде изменяются непрерывно. Вследствие этого непрерывная культура предоставляет уникальные возможности для исследования реакций микроорганизмов на изменение окружающей среды и для непрерывного продуцирования клеточной массы или др. продуктов в оптимальных условиях.

По степени распространения из систем непрерывного культивирования наиболее широкое распространение получили такие системы, как хемостат, турбидостат и система непрерывного культивирования поршневого типа (полного вытеснения).

 

Тема 5. ТЕХНОЛОГИЯ ГЛУБИННОГО СПОСОБА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ.

БИОРЕАКТОРЫ.

 

Технологическая схема стадии культивирования микроорганизмов, отделения, концентрирования биомассы и инактивации биомассы приведена на рис.

Технологический процесс глубинного выращивания микроорганизмов в биореакторах (ферментерах) складывается из следующих типов:

1. Отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними.

2.Приготовление посевной микробной культуры.

3. Приготовление и стерилизация питательных сред.

4. Подготовка биореактора к посеву.

5. Выращивание микроорганизмов в биореакторе и контроль над процессом культивирования.

Кроме того, он включает ряд вспомогательных операций:

- стерилизацию оборудования и коммуникаций;

- приготовление и стерилизацию пеногасителей, растворов и др.

 

Отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними

Эталонные или референтные штаммы хранятся и поддерживаются на заданном уровне в контрольном институте ветеринарных препаратов. Эти штаммы, в свою очередь, являются производственными, поскольку на их основе готовятся вакцины.

При этом инактивированные вакцины, как правило, готовятся из высоковирулентных штаммов, а живые вакцины — из аттенуированных (ослабленных), авирулентных штаммов.

Наряду с производственными, эталонными штаммами хранятся контрольные штаммы, которые используют для оценки качества вакцинных препаратов. Эти штаммы должны быть генетически однородными популяциями микроорганизмов со стабильными морфологическими, специфическими и биологическими свойствами. Основным требованием к этим штаммам является их высокие антигенные иммуногенные свойства.

Антигенность штаммов оценивается по титру антител в сыворотке крови чувствительных животных через определенные сроки после проведения им микроорганизмов.

Иммуногенные свойства штаммов определяются по устойчивости привитых животных к заражению возбудителем болезни определенной дозой контрольного (вирулентного) штамма и выражают 50%-й дозой иммуногенности (ИМД5о) или по нарастанию титра антител в сыворотке крови. При этом 80% привитых животных должны быть специфически невосприимчивы к инфекции.

Безвредность (реактогенность) эталонного, производственного штамма проверяют по выраженности реакции у лабораторных и естественно-восприимчивых животных на 5 - 10-кратное увеличение прививочной дозы.

Производственные, эталонные штаммы должны сохранять генетическую стабильность антигенных, иммуногенных и др., присущих им биологических свойств на протяжении 10-20 последовательных пересевов как in vivo, так и in vitro.

 

Приготовление посевной микробной культуры

Обычно производственное культивирование микроорганизмов при изготовлении вакцин осуществляют в больших объемах. Поэтому вначале из имеющегося эталонного штамма микроорганизма, находящегося, как правило, в лиофильно высушенном состоянии в ампуле, делают посевы в небольшие емкости (например, во флаконы емкостью 200 см³, выполненные по 100 - 150 мл производственной средой). Затем из флаконов делают высевы в большие емкости-бутыли на 18-29 л.

При достаточном накоплении микроорганизмов такую культуру вносят в инокулятор и называют посевной (матрацной, матровой, маточной). При этом нужно предварительно рассчитать необходимое количество посевной культуры для производственного культивирования микроорганизмов, исходя из посевной дозы, которая обычно составляет от 1 до 10% по объему. Посевные микробные культуры также контролируются на сохранение типичных морфологических, культурально-биохимических, антигенных и иммуногенных свойств и отсутствие в них ПМФ.

 

Приготовление и стерилизации питательных сред

В промышленных условиях питательные среды обычно готовят в отдельном цехе, обеспечивающем потребности всех основных цехов завода. Для приготовления питательных сред используют деминерализованную воду. Среды готовят в емкостях, снабженных механическими мешалками, добавляя в определенной последовательности растворимые компоненты (соевая мука, кукурузная мука, мел). При необходимости отдельные компоненты подвергают дополнительной работке: измельчению, просеиванию, отвариванию, экстрагированию и т.д.; крахмалосодержащее сырье стерилизуют. Для лучшего растворения компонентов среду нагревают до 70-80°С острым паром.

При приготовлении питательных сред для глубинного культивирования особое внимание уделяют тщательной гомогенизации компонентов сред. Твердые частицы нерастворимых компонентов должны быть достаточно мелкими, это облегчает их потребление микроорганизмами и обеспечивает надежность стерилизации, т.к. крупные частицы медленнее прогреваются, резко повышается вероятность сохранения в них посторонней микрофлоры, особенно при непрерывной стерилизации.

Приготовленную питательную среду передают в цех культивирования, стерилизуют в установках непрерывной стерилизации (УНС) и заполняют его предварительно простерилизованные реакторы. В некоторых случаях среду стерилизуют непосредственно в биореакторе (обычно при небольших объемах среды). Биореактор заполняют на 0,7 его объема. Перед началом культивирования берут пробы среды с целью определения качества стерилизации. Это достигается путем высева из отобранных проб на МПБ, МПА, агар Сабуро или Чапека.

 

Биореакторы

Основным оборудованием для глубинного культивирования микроорганизмов является биореактор. Определение данного оборудования как биореактор больше соответствует его функциональному назначению - осуществление процессов биосинтеза. Основной функцией биореакторов является обеспечение условий для роста микроорганизмов, клеток животных и вирусов в заданных условиях. Следовательно, основной задачей при использовании биореакторов является обеспечение его надежности при культивировании в течение периода от нескольких часов до многих дней.

Конструкции биореакторов различны. Рабочий объем биореактора обычно не превышает 0,7 общего объема. Свободное пространство над поверхностью раствора используется как буферное, где накапливается пена и таким образом предотвращается потеря культуральной жидкости. Исследования показали, что в пенящейся жидкости условия аэрации лучше, чем в плотных растворах, при условии непрерывного перемешивания и циркуляции слоя пены, те при исключении длительного нахождения микроорганизмов вне культуральной жидкости.

Тип биореактора, металл и другие материалы, из которых он изготовлен, чистота обработки внутренних стенок аппарата и отдельных его узлов, емкость, коэффициент заполнения, поверхность теплопередачи и способ отвода тепла, тип перемешивающего и аэрирующего устройства, арматура и запорные приспособления, способ пеногашения, средства автоматизации технологических параметров процесса - вот далеко не полный перечень отдельных элементов, которые в отдельности и во взаимосвязи влияют на процесс культивирования микроорганизмов и клеток.

Хотя конструкция биореакторов для глубинного культивирования микроорганизмов и не поддается шаблону, однако можно предварительно сформулировать ряд следующих основных требований к аппаратам подобного типа:

- гомогенность культуральной среды;

- оптимальные массо- и теплообменные характеристики по потреблению питательных веществ и отводу продуктов метаболизма;

- обеспечение стерильности посева, взятия проб и процесса культивирования;

- простота наладки и обслуживания;

- стандартность блоков оборудования для культивирования;

- возможность осуществления масштабного перехода;

- возможность автоматического контроля и регулирования основных параметров культивирования.

В поисках оптимальной конструкции биореактора часто нецелесообразно останавливаться на наиболее дешевой, можно работать и на простом оборудовании, но необходимо иметь в виду, что на нем нельзя получить необходимой информации и высоких результатов.

При выборе конструкции посевного биореактора (инокулятора) следует учитывать некоторые технические требования:

- инокулятор должен быть максимально простым по конструкции и с минимальным числом штуцеров и передаточных устройств;

- в инокуляторе необходимо обеспечить оптимальные гидродинамические и массобменные условия.

Биореакторы изготавливают из высоколегированных марок сталей. Внутренняя поверхность биореактора для глубинного культивирования микроорганизмов должна быть отполирована.

Биореакторы должны быть достаточно простыми в обслуживании: работа отдельных узлов необходимо контролировать. Должны регулироваться отдельные физико-химические параметры культивирования (температура стерилизации и культивирования, рН, еН, рОг рС0₂, скорость вращения мешалки, давление, расход воздуха или газов на аэрацию, пенообразование). Соответствующая гидродинамическая обстановка в биореакторе, а следовательно и процессы тепло- и массообмена, поддерживаются с помощью специальной конструкции перемешивающих устройств, диспергаторов газа (барботеры) и наличия отражательных перегородок (отбойников). Кроме того, важное значение (особенно при масштабировании культивирования) имеют геометрические соотношения отдельных элементов биореактора.

В лабораторных и пилотных установках для глубинного культивирования часто корпус изготавливают из термостойкого и нейтрального стекла, а крышку - из нержавеющей стали с вводом через нее перемешивающего устройства, патрубков и датчиков.

Более подробно рассмотрим характеристики биореакторов, функционирующих с жидкой и газовой фазой, с механическим и барботажным диспергированием, которые часто используют для глубинного культивирования микроорганизмов при производстве биопрепаратов.