Основные этапы производства противовирусных вакцин

 

Накопление вирусного материала. Прежде чем приступить к производству какого-либо вида вирусной вакцины, необходимо получить определенное количество вирусного материала. В отличие от бактерий, вирусы не растут ни в каких-либо других условиях, кроме как в клетках живых организмов.

При использовании целостных организмов для накопления вирусов возникают немалые сложности. Каждый живой организм обладает спектром индивидуальных свойств, зависящих от самых различных причин, но все они влияют на успех заражения.

Выбор животного того или иного вида и возраста зависит от применяемого вида вируса. Наиболее широко используют белых мышей (альбиносов серой домашней мыши), крыс (альбиносов серой крысы), хомяков (сирийский золотой хомяк), морских свинок, кроликов. Не так часто используют хорьков, собак, обезьян и кур.

Инфекционный материал лабораторным животным вводят с учетом особенностей репликации и специфичности тропизма вируса:

- оральное и ректальное введение - для энтеровирусов;

- интраназальное и ингаляционное - для респираторных вирусов;

- перкуганное и кутанное - для дерматропных вирусов;

- интрацеребральное, субдуральное, люмбосакральное - для нейротропных вирусов;

- интрамускулярное, ингравенозное, интраперитониальное, инграплевральное и т.п. - для вирусов со смешанным тропизмом.

При использовании в качестве живой системы куриных эмбрионов применяют различные пути их заражения вирусом: в полость амниона, хорионаллантоисную оболочку, полость аллантоиса, желточный мешок.

Но куриные эмбрионы не совсем универсальны - есть вирусы, которые в них не размножаются.

Поэтому для промышленного производства противовирусных вакцин используют, в основном, культуры клеток.

В настоящее время вакцины, получаемые в культурах клеток, отличаются большим разнообразием: в больших количествах выпускаются вакцины против ящура, ньюкаслской болезни, болезни Марека, бешенства, чумы собак, гепатита собак, чумы крупного рогатого скота, оспы овец, птиц, энцефалитов лошадей и т.п.

 

Индикация, идентификация и определение титра вируса. После накопления вирусов в клетках, следующим этапом в производстве вакцин является индикация, идентификация и определение титра вирусного материала.

Прямое непосредственное выявление вирусов возможно лишь с помощью электронного микроскопа при условии, что в пробе содержится не менее 10 - 100 тыс. вирионов в 1 мл. Этот метод не всегда можно применить (в основном применяют для ротавирусов - возбудителей энтеритов).

При заражении лабораторных животных, куриных эмбрионов вирус обычно идентифицируют по специфическим патологическим изменениям, которые он вызывает внутри организма. Репродукция вируса в клеточных культурах отражается цитопатогенным действием вируса на клетки культуры.

Вирулентность вирусов оценивается количеством инфекционных единиц.

Под инфекционной единицей понимают наименьшее тестируемое количество вируса. Титр вируса (количество инфекционных единиц, содержащееся в 1 мл препарата) определяется с помощью методов предельных разведений и подсчета локальных повреждений или бляшек.

Метод подсчета локальных повреждений (бляшек, или негативных колоний) используется в основном для титрования вирусов, вызывающих деструкцию (лизис) клеток. На монослой клеток наносится некоторое количество инфекционных вирусных частиц (от единиц до нескольких десятков). Зараженный монослой инкубируют в условиях, при которых потомство вируса, образовавшееся в первоначально зараженных клетках, не свободно распространяться по клеточному слою, однако дочерние 'частицы способны инфицировать клетки, расположенные в непосредственной близости от первоначально зараженной клетки. Чтобы ограничить распространение вируса по клеточному слою, обычно используют агаровое покрытие.

Для обнаружения негативных колоний используют метод прижизненного окрашивания клеток нейтральным красным. Живые клетки накапливают краску, погибшие - ее теряют, поэтому участки клеточного пласта, поврежденные вирусом, выглядят светлыми пятнами на фоне окрашенных клеток.

Зависимость между числом образовавшихся бляшек и числом инфекционных вирусных частиц в препарате строго линейная, и, следовательно, одна бляшка соответствует одной инфекционной единице.

Конечный результат титрования выражается количеством бляш-кообразующих единиц (БОЭ). Титр вируса, выраженный как число БОЭ в 1 мл, отражает количество вирусных частиц в 1 мл препарата, способных вызвать инфекционный процесс.

Но чаще о вирусах в материале судят опосредовано, через взаимодействие вирусов с антителами, эритроцитами - путем проведения реакций гемагглютинации и серологических реакций различных модификаций. Эти реакции очень чувствительны и показательны, с их помощью можно определить количество вирусного материала, используя метод предельных разведений.

Для этого готовят серию последовательных разведений инфекционного препарата, достигая в итоге такого разведения вируса, при котором суспензия утрачивает инфекционность.

При заражении вирусом чувствительных животных или клеточных культур у части объектов развивается инфекционный процесс, регистрируемый по гибели животных, по дегенерации клеток или другими методами. На основании полученных результатов вычисляют титры вируса.

За эффективную дозу инфекционного материала обычно принимают разведение испытуемого вируса, при котором определенная часть подопытных объектов проявляет типичную реакцию или гибнет. Оптимальная эффективная доза при оценке инфекционности - доза, вызывающая специфическую реакцию у половины подопытных объектов.

Доза вируса, способная заразить 50 % подопытных объектов, называется 50 %-ой инфицирующей дозой (ИД₅₀).

Если критерием при оценке эффективности действия вируса является гибель объектов, то используют 50 % легальною дозу (ЛД₅₀), при титровании на эмбрионах - 50 % эмбриональную инфицирующую дозу (ЭИД₅₀), при титровании на клеточной культуре это доза, вызывающая цитопатическии эффект в 50 % зараженных культур (ЦПД₅₀).

Также легко и быстро можно определить титр вируса в различных модификациях реакций гемагглютинации, так как многие вирусы способны склеивать эритроциты. Для этого готовят серию последовательных двукратных разведений вируса и добавляют к ним определенное количество эритроцитов. Там, где количество вируса было достаточно для полной агглютинации, наблюдается образование глыбок из эритроцитов, которые быстро опускаются на дно, образуя на всей поверхности дна розовую пленку. В отсутствие вируса эритроциты оседают на дно в виде компактного осадка -«пуговицы». Возможна промежуточная картина, когда часть эритроцитов агглютинирована в то время как другая часть осела в виде компактного осадка.

Конечной точкой титрования считается такое разведение вируса, при котором наблюдается агглютинация примерно половины добавленных эритроцитов. Количество гемагглютинирующих частиц, внесенных в лунку, принимают за единицу.

Но, чаще всего вирус идентифицируют и определяют его титр в серологических реакциях, также используя метод предельных разведений до такой степени, в которой вирус уже не обнаруживается. При этом вирус идентифицируют с помощью антител, предотвращающих гемагглютинацию вирусами эритроцитов в реакциях РТГА (торможения гемагглютинации), РЗГА (задержки гемагглютинации), РПГА (подавления гемагглютинации), а также используют реакции связывания комплемента, иммуноферментного анализа, радиоиммунного анализа, твердофазного иммунологического анализа и другие.

Выделение, очистка и концентрирование вирусного материала. После накопления, индикации, идентификации и титрования вирусов проводят выделение и очистку вирусного материала от балластных примесей, ибо в каком бы субстрате его ни накапливали, на одну вирусную частицу приходятся миллионы никак с ней не связанных, а относящихся к среде, где этот вирус репродуцировался.

Очистка вирусного материала - непременная операция вакцинного производства, обеспечивающая получение более сильнодействующих и безопасных препаратов.

Вакцины в первую очередь должны обладать биологической безопасностью, т.е. должны исключаться возможности контаминации препаратов бактериями, вирусами, отличающимися от специфического вакцинного штамма, или же фрагментами клеток и вирусной ДНК. Поэтому после выделения вируса материал проверяют на стерильность путем посева на питательные среды. Таким образом можно выявить лишь бактериальную загрязненность, но не контаминацию другими агентами

После проведения очистки трудно провести дифференциальную инактивацию или отделить такие агенты от целевого вируса. Поэтому биологическая «чистота» должна гарантироваться тщательным биологическим контролем всех исходных материалов, используемых в производстве, и жестким выполнением правил производственной асептики.

Очистка вирусов связана также с отделением от него питательной среды и клеточных компонентов, которые могут наряду с нужным действием вакцины оказывать на организм вакцинируемого животного побочное действие или же провоцировать иммунные реакции, не связанные с защитным действием вакцины. Это может привести к аллергическим или сенсибилизационным реакциям организма, даже к выработке антител, которые могут вступать в перекрестные реакции с белками организма-хозяина. Вообще очистка вирусов рассматривается как удаление гетерологических белков (иммуногенов) и частиц.

Химическая чистота, как правило, не является обязательной. Иногда размножение вируса приводит к разрушению инфицированных клеток и выходу вируса в среду, но чаще накопление вируса не вызывает деградации клеток. Поэтому в большинстве случаев первой стадией очистки вирусов является разрушение инфицированных клеток с целью перевода синтезированного вируса в культуральную среду.

Разрушают клетки чаще всего различными механическими способами, которые вызывают дезинтеграцию клеток, но не приводят к разрушению вирусных частиц. Иногда для этой цели используются и химические методы. В результате разрушения зараженных клеток получают суспензию, содержащую клеточные компоненты и вирусные частицы, причем вирус в суспензии оказывается сильно разбавленным.

Задача получения вирусного препарата сводится, таким образом, к концентрированию вируса (увеличению числа вирусных частиц в 1 мл суспензии) и к его очистке, то есть удалению клеточных компонентов. Обычно эти задачи решаются параллельно.

Для очистки и концентрирования вирусов используются ряд операций, так как различные методы очистки освобождают препараты вируса от разных групп примесей.

На стадии очистки определяющее влияние оказывают такие фундаментальные процессы всего вирусного производства, как выбор продуцирующих клеток и условия продуцирования.

Очистка и концентрирование вирусов, как правило, осуществляется в три стадии:

1. Осветление клеточного лизата.

Проводится с целью удаления из культуральных жидкостей остатков клеток, упрощения дальнейшей очистки и для облегчения эффективной обработки вирусов инактивируюшими агентами.

Осветление осуществляется методами седиментации, фильтрации и центрифугирования.

а) Седиментация.

Если клеточную систему не перемешивать, не подводить в нее энергию и если эта система не зависит от прикрепляемости клеток к твердым поверхностям, то содержащиеся в ней клетки и связанные с ними фрагменты оседают (седиментируют). С помощью сифонной трубки или разгрузочного патрубка надосадочную жидкость и осевшие клетки можно отделить друг от друга.

б) Центрифугирование.

На этой стадии обычно применяют низкоскоростное центрифугирование (3000 - 5000 об/мин в течении 10-20 мин), позволяющее удалить из суспензии крупные частицы. При этом часть вируса теряется за счет адсорбции на удаляемых частицах. Поэтому часто осадок подвергают промывке для освобождения хотя бы части адсорбированного на нём вируса. Для уменьшения адсорбции низкоскоростное центрифугирование стараются проводить фазу же после разрушения клеток. Обычно используют непрерывно-поточное центрифугирование. Сила центрифугирования при этом, относительно небольшая (g), но скорость потока достигает 45 л/ч при частоте вращения 6000 об/мин. Чтобы сконцентрировать или осадить сам вирус, жидкость пропускают через ту же машину (роторы для непрерывно-поточного центрифугирования присоединяют к обычным центрифугам, что позволяет обеспечить высокие скорости потока, до 100 л/ч), но при частоте вращения 20 000 об/мин и со скоростью 3 л/ч, т.е. при более эффективном использовании ротора.

в) Фильтрация.

Применяют различные фильтрующие материалы в виде дисков, складчатых патронов или пластин, любой из них при этом крепится специальными держателями или кронштейнами. Для изготовления фильтров применяют стеклоасбестовые материалы, стекловолокно, полипропилен, целлюлозу с диатомиговой землей. В качестве вспомогательных фильтрующих материалов обычно применяют активированный уголь, диатомит, перлит (естественный вулканический минерал) и целлюлозные волокна.

2. Концентрирование и очистка вирусной суспензии.

а) Методами преципитации, то есть осаждения при помощи нейтральных солей или органических растворителей. В целом методы преципитации не нашли признания в промышленности из-за нескольких серьезных недостатков: при преципитации в систему вводятся посторонние компоненты, которые в последующем должны быть удалены диализом или гель-фильтрацией; селективность метода недостаточна высока и степень очистки часто ограничена.

б) Адсорбция-элюирование - при этом используют ряд неспецифических адсорбентов (в виде геля фосфат кальция, двуокись кремния, двуокись алюминия и др.). Однако вирусы проявляют склонность к специфическому связыванию определенными видами адсорбентов. Поэтому такие адсорбенты наиболее часто используют в системе адсорбция-элюирование. Разработан процесс очистки и концентрирования, основанный на адсорбции вирусов к нерастворимому комплексу, образуемому высокомолекулярным полимером этиленоксидом и ионами кальция. Сформированный с частицами вируса тройной комплекс выводится из системы преципитацией, а затем выделяется из смеси центрифугированием. Диссоциацию комплекса можно производить при очень мягких условиях с использованием кальциевых агентов. Данный метод используют при (порядка нескольких тысяч литров) с целью получения препаратов вируса чистотой 50 - 90 %. Однако некоторые вирусы необратимо связываются с ионообменной смолой, поэтому этот метод не получил широкого промышленного распространения.

в) Ультрафильтрация - процесс, с помощью которого смесь вещества различной молекулярной массы в жидкой фазе подвергается делению при прохождении ее под давлением через мембраны, имеющие определенные размеры пор. Для концентрирования и диализа вирусов в крупномасштабном производстве метод ультрафильтрации незаменим и имеет ряд преимуществ: он не связан с добавлением посторонних агентов в вируссодержащую суспензию, заданные значения рН могут поддерживаться на протяжении всего процесса, наличие аппаратуры для осуществления крупномасштабных прерывных операций в контролируемых условиях, мембраны могут использоваться многократно без потери эксплуатационных характеристик.

3. Полная очистка концентрированной суспензии.

а) Очистка центрифугированием в градиенте плотности – скорость седиментации (т.е. осаждения и отделения друг от друга) частиц в
центробежном поле зависит от размера и форм частиц. Лучшее выделение
частиц, характеризующихся одинаковой скоростью седиментации, может
быть достигнуто, если центрифугирование производить в градиенте
плотности. При этом проявляются два положительных свойства метода: зоны
стабилизируются против деформации под воздействием конвекции, и в
качестве дополнительного параметра пения в систему вводится так
называемая плавучая плотность частицы. В градиенте плотности частицы
продолжают оседать до тех пор, пока не достигнут своей изопикнической
плотности. До того, как они достигнут этого уровня в градиенте, сепарация
будет происходить, согласно скорости седиментации частиц данного
размера, плавучей плотности частиц и, в меньшей степени, формы частиц.

б) Аффинная хроматография вирусов (или хроматография по сродству)
подразумевает систему разделения при помощи лиганд с биологической
специфичностью в отношении выделяемых молекул. Лиганды фиксированы
на инертном носителе таким образом, что они доступны для специфического
взаимодействия с молекулами. Неочищенную смесь, в которой содержатся
подлежащие выделению вирусы, заливают в аффинную колонку, которая
будет задерживать только эти вирусы. Все посторонние компоненты смеси
будут удаляться из колонки при промывании.

в) Хроматография вирусов по размерам - т.е. вирусы «процеживаются»
через колонки с пористой стандартной фазой. Мелкие молекулы могут
проникать внутрь этой фазы и, таким образом, задерживаться в ней, в то
время как более крупные вирусы «отсеиваются» и проходят без помех.

Критерии чистоты вирусных препаратов. В процессе выделения вирусного препарата используются различные способы оценки степени очистки вируса от клеточных компонентов. Процесс препаративного выделения любого вируса осуществляется при постоянном биологическом контроле.

Для оценки степени чистоты и гомогенности очищенного препарата используются следующие критерии:

1. Наличие одного компонента на седиментационной диаграмме при проведение опытов в аналитической ультрацентрифуге свидетельствует о довольно высокой степени очистки и в некоторых случаях о монодисперсности препарата.

2. Наличие одного компонента при исследовании препаратов методом аналитического электрофореза свидетельствует об идентичности поверхностного заряда частиц растворенного вещества.

3. Чистый вирусный препарат при исследовании в электронном микроскопе должен содержать только вирусные частицы при полном отсутствии неспецифических агрегатов балластных веществ.

4. Исследование вирусного препарата методом центрифугирования в градиенте плотности позволяет обнаружить присутствие примесей, отличающихся по величине плавучей плотности от вирусного нуклеопротеида. Таким образом было показано, что препараты ряда вирусов негомогенны по плотности (состоят из нескольких компонентов, различающихся по содержанию нуклеиновой кислоты).

5. Контроль степени чистоты вирусного препарата с помощью иммунохимических или серологических методов. Для этих целей используется антисыворотка к выделенному вирусу и антисыворотка к антигенам здорового хозяина. При идеальной чистоте препарата антисыворотка к вирусу не будет реагировать с антигенами нормальной клетки и, наоборот, антисыворотка с нормальным антигеном не будет реагировать с вирусным препаратом, так как он не содержит антигенов нормальной здоровой клетки.

Так как распределение дискретных физико-химических свойств между элементами вирусов четко произвести нельзя, то для того, чтобы убедиться в отсутствии потенциальных контаминантов, наиболее подходящими оказались серологические методы. Они в совокупности с другими (физическими, химическими или биологическими) тестами, придающими оценке препарата законную силу, могут составлять основу спецификации продукта.

Определение концентрации очищенных препаратов. Для определения концентрации очищенных препаратов могут использоваться следующие методы:

- электронно-микроскопические - подсчет числа частиц в микро-капле испытуемой жидкости в поле зрения микроскопа;

- иммунологические - определение титра вирусного антигена;

-биологические-титрование по инфекционности или гемагглютинирующей активности;

- определение концентрации вируса по сухому весу;

- определение содержания вирусной нуклеиновой кислоты в препарате по цветным реакциям на рибозу или дезоксирибозу, либо по содержанию фосфора. Этот метод достаточно точен, но требует использования препаратов вирусов, свободных от примеси клеточных нуклеиновых кислот;

- спектрофотометрический метод - определение концентрации по величине поглощения света определенной длины волны с использованием известного коэффициента поглощения данного вируса. Он очень широко используется, так как достаточно прост и удобен.

Последовательность следующих этапов при производстве вакцин будет зависеть от того, какой тип вакцины производят.

Обычно все противовирусные вакцины делят на следующие типы:

1. Живые вакцины:

а) из аттенуированных вирусов возбудителя (получение апатогенных штаммов из высокопатогенных производится путем аттенуации последних с помощью последовательных пассажей на культурах клеток или через организм не восприимчивых животных, либо с помощью физического и химического мутагенеза, либо селекцией природно-ослабленных штаммов в условиях латентных или атипично протекающих инфекций);

б) из апатогенных вирусов, серологически близких патогенным (определенному патогенному типу вируса, против которого разрабатывается вакцина подыскивается серологически близкий тип вируса, который апатогенен для человека или животных);

в) из рекомбинантных апатогенных вирусов (создание вакцинных штаммов вирусов производится путем рекомбинации генов вирулентного и невирулентного штаммов вирусов, протекающей после совместного заражения ими культуры клеток или куриных эмбрионов).

2. Убитые (инактивированные) вакцины:

а) корпускулярные или цельновирионные вакцины - их получают из цельных вирусов, путем инактивации их физическими или химическими методами;

б) из расщепленных вирусов, путем дезинтеграции их различными способами с целью удаления либо инактивации генетического материала вируса:

- сплит-вирусные вакцины - из поверхностных структур вируса (капсиды и суперкапсиды), содержащих в составе этих структур или на их поверхности антигены, которые обладают протективной активностью;

- субъединичные вакцины;

3. Молекулярные вакцины.

4. Полипептидные вакцины (получают на основе протективных антигенов, выделенных непосредственно из вируса).

5. Синтетические вакцины (антигенные детерминанты получают методами химического синтеза).

6. Генноинженерные вакцины (протективный антиген вируса или его антигенноактивную часть получают с помощью генноинженерной технологии).

Проблема получения живых вакцин решается довольно успешно, при их производстве требуется надежный контроль биологических систем, используемых для репродукции, а также генетический контроль и использование методов поддержания живых вакцин в первозданном виде.

В принципе, выделенный, очищенный, сконцентрированный и проверенный аттенуированный вирусный материал - это и есть вакцина. Далее его консервируют в жидком состоянии (обычно применяют 50% глицерин) или методом лиофильного высушивания, расфасовывают во флаконы или ампулы.

Инактивация вирусного материала. Для инактивации применяют следующие агенты:

- формальдегид, глицидальдегид - для инактивации вирусов ящура, энцефалитов лошадей, чумы собак, трансмиссивных гастроэнтеритов;

- ацетилэтиленимин, этиленимин - в основном для инактивации вируса ящура;

- пропиолактон - для инактивации вирусов ящура, болезни Ньюкасла, бешенства, чумы свиней;

- гидроксиламин - для вирусов гриппа свиней, чумы птиц;

- кристалвиолет, ионы аммония чаще применяют в комбинации с другими инактивирующими агентами;

-ультрафиолетовое облучение (как инактивирующий агент) использовалось в сочетании с пропиолактоном для получения вакцин на основе вирусов ящура и болезни Ньюкасла;

- рентгеновское и гамма облучение - для инактивации вируса гриппа;

-тепловое воздействие на вирусы в целях уничтожения их
инфекционности при сохранении иммуногенности крайне ограничено (в
основном температуру учитывают как критический фактор при инактивации
вирусов с применением химических средств).

На практике в большинстве случаев для инактивации применяют неспециализированное оборудование. Для химической инактивации вирусов в суспензиях подходит относительно простое оборудование емкостного типа. При его подборе особое внимание уделяют достижению полного перемешивания смеси инактивириующий агент/вирус в течении всего периода инактивации для того, чтобы ни одна вирусная частица не избежала контакта с инактивантом.

Обычно принято смешивать инактивант с вирусной суспензией в одном сосуде, а затем переносить эту смесь в другой сосуд. Благодаря этому частицы неинактивированного вируса будут оставаться в первом сосуде. В ходе инактивации рН и температура должны строго контролироваться и регулироваться, и притом не просто для поддержания их постоянными, но, прежде всего, для сохранения, насколько это возможно, иммуногенности лабильных вирусов

Поскольку инактивирующие агенты легко реагируют с невирусными белками и некоторыми компонентами питательных сред, необходимо перед инактивацией вирусных суспензий фильтрацией удалить остатки клеток.

Процессы инактивации, основанные на применении УФ-света или видимого света в сочетании с красителями, требуют применения более сложного оборудования, которое гарантирует адекватное проникание радиации в вирусную суспензию. Например, источник радиации располагают в центре пространственной спиральной трубки из пластика, проницаемого для радиации, или же центрифугируют вирусную суспензию в виде тонкой пленки вокруг источника света.

Поскольку время экспонирования при инактивации вирусов имеет критическое значение, скорость течения жидкости через систему быть строго определенной.

Основное различие между вакцинами из живых аттенуированных и инактивированых вирусов заключается в количестве вирусного материала входящего в иммунизирующую дозу. Инактивированные вакцины должны содержать в дозе достаточное количество вирусного материала, чтобы стимулировать иммунную систему организма. Лишь при таком условии реципиент сможет получить защиту от возможного инфицирования. Главная проблема технологии производства инактивированных вакцин и состоит в том, чтобы в дозу было включено достаточное количество вирусного антигена.

Если для дозы живой аттенуированной вакцины достаточно иметь титр вируса около 10³ ТСД₅₀, то для эффективного проявления инактивированной вакцины необходимо использовать ее эквивалент, оцениваемый титром 10 -10⁸ТСД₅₀.

Следовательно, концентрация вируса в дозе инактивированной вакцины должна превышать таковую в дозе живой аттенуированной вакцины в 10-100000 раз. Найти клеточную систему, в которой вирус мог бы размножаться в достаточно высоких титрах, пригодных для непосредственного приготовления инактивированной вакцины, не всегда возможно. В таких случаях приходится прибегать к технике концентрирования, позволяющей получать препараты с достаточными титрами вируса.