Темы лабораторно – практических занятий

БИОТЕХНОЛОГИЯ

(учебное пособие часть II)

по специальности ветеринарно-санитарная экспертиза,

квалификация «Бакалавр»

 

Казань - 2013 г.

 

Учебное пособие «Биотехнология» часть II (практикум) написано профессорами Госмановым Р.Г. и Галиуллиным А.К. и предназначено для студентов, обучающихся по специальности ветеринарно-санитарная экспертиза, квалификация «Бакалавр».

 

Печатается по решению Ученого совета факультета ветеринарной медицины КГАВМ им. Н.Э.Баумана от 20 ноября 2013 г., протокол № 10.

 

Рецензенты: проф. И.Н. Никитин

 

 

ТЕМЫ ЛАБОРАТОРНО – ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ

Тема 1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА

И ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Стадия приготовления посевного материала

Штаммы микроорганизмов для производства биологических препаратов поступают на биопредприятие в виде чистых культур, законсервированными в ампулах. Каждая культура штамма имеет паспорт с описанием культурально-морфологических, биохимических и биологических свойств микроорганизма, характеристики сред и условий для их поддержания, выращивания, срока и условий хранения и транспортировки.

В основе хранения культур лежит охлаждение, замораживание или обезвоживание. Во всех этих случаях должен быть резко сокращен или полностью прекращен клеточный обмен веществ.

На практике культуры штаммов хранят с использованием следующих основных способов:

- на скошенном агаре при температуре -1 - -5 °С;

- замораживание со стабилизатором и хранение при температуре ниже -20 ° С. Недопустимо многократное оттаивание и замораживание;

- лиофилизация культуры и хранение в ампулах в течение нескольких лет.

Через определенное время, оптимальное для каждого способа хранения, культуру пересевают.

Перед началом технологических процессов культуру размножают в стерильных условиях.

Для приготовления посевного материала используют полноценную среду. Количество питательной среды в инокуляторе и биореакторе должно превышать 70% от общего объема. Если культуру в инокулятор вносят из колб, то количество посевного материала составляет примерно 0,1% объема питательной среды.

Для промышленных биореакторов обычно используют от 6 до 10% инокулянта. С плотной питательной среды выросшую культуру смывают стерильной питательной средой или физраствором и вносят в инокулятор в таком же объеме как и жидкую.

Тема 2. КЛАССИФИКАЦИЯ СПОСОБОВ И СИСТЕМ

КУЛЬТВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

 

Для осуществления любого биотехнологического процесса мик-робного синтеза необходимы культура микроорганизмов, питательная

 

 

среда, аппаратура для выращивания и проведения вспомогательных операций, средства контроля и управления.

Культивирование является основной стадией технологического процесса и во многом определяет количественные и качественные характеристики производства биопрепаратов.

На стадии культивирования осуществляется накопление, как самой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности) микроорганизмов.

Иногда (например, при производстве бактериальных препаратов) целевым продуктом является сама биомасса, в других случаях - продукты, синтезируемые клеткой (антибиотики, ферменты, аминокислоты и др.). При этом синтезируемый продукт может накапливаться как внутри клеток, так и выделяться в культуральную жидкость.

Необходимые полезные свойства целевых продуктов (клеток или продуктов метаболизма) создаются, в основном, на стадии культивирования. Основная задача на последующих стадиях состоит в том, чтобы при выделении, сушке и других операциях максимально сохранить и стабилизировать эти полезные свойства.

 

Классификация способов и систем культивирования

Микроорганизмов

 

Культивирование микроорганизмов осуществляется следующими основными способами: поверхностное, глубинное, периодическое, отъемно-доливное и непрерывное.

При твердофазном поверхностном культивировании клетки растут на поверхности твердой (плотной) среды, содержащей достаточное количество влаги и питательных веществ.

При жидкофазном поверхностном культивировании микроорганизмы растут на поверхности жидкой питательной среды, потребляя содержащиеся в ней субстраты и выделяя в эту среду продукты метаболизма.

При глубинном культивировании микроорганизмы распределяются по всему объему жидкой питательной среды, а источники газообразных продуктов питания (кислород, углекислый газ, азот) и компоненты питательной среды поступают к микроорганизмам в результате аэрации и перемешивания.

Глубинный способ культивирования микроорганизмов наиболее широко используется в производстве большинства биопрепаратов по следующим причинам:

1. Позволяет получить за более короткое время большее количество бактериальной массы или продуктов биосинтеза. Так, при культивировании микроорганизмов группы кишечной палочки в поверхностных условиях, количество микробов не превышает 1-2 млрд в мл применением глубинного культивирования, в зависимости от состава питательной среды и режимов культивирования, достигает 50-60 млрд. в мл.

2.Возможность осуществить управляемое культивирование, при котором основными управляющими воздействиями являются: аэрация, перемешивание, подача хладоагента или теплоносителя, титрантов для регулирования концентрации водородных ионов (рН), редуцентов для регулирования окислительно-восстановительного потенциала (еН) культуральной жидкости, пеногасителей для регулирования уровня пены в биореакторе, дозирования необходимых для оптимального роста культуры микроорганизмов азотных, углеводных, фосфорных и других субстратов, а также предшественников биосинтеза.

3.Возможность использования стандартного механизированного и автоматизированного технологического оборудования для культивирования (инокулятор, биореактор, что обеспечивает снижение подготовительных операций и операций съема биомассы) и повышения качества биопрепарата.

Для роста биомассы и биосинтеза продуктов метаболизма при культивировании необходимо соблюдение следующих условий:

- жизнеспособность посевного материала;

- наличие источника энергии;

- содержание в питательной среде компонентов, необходимых для синтеза биомассы;

- отсутствие в среде ингибиторов;

- поддержание в культуральной жидкости необходимых физико-химических условий жизнедеятельности культуры микроорганизмов.

 

Параметры роста

Основные факторы, влияющие на рост и развитие микроорганизмов, можно подразделить на две группы: внутриклеточные факторы, обусловленные структурой и специфическими особенностями организма, и внеклеточные факторы, т.е. условия внешней среды клетки. К внутриклеточным факторам относятся структура клетки, механизмы метаболизма и генетические характеристики, что является прерогативой цитологических, биологических и генетических исследований. Основной целью исследований в биотехнологии являются внеклеточные (внешние) факторы.

Для количественной характеристики роста микроорганизмов анализируются основные параметры роста.

Контроль роста. Под определением «биомасса» подразумевается общая концентрация микроорганизмов или клеток на твердой или жидкой питательной среде при культивировании. Выбор метода измерения зависит от задач исследований в области культивирования, биохимической характеристики культуры, питательной среды и требуемой точности измерений. Наименее чувствительным является метод определения веса сухой биомассы, а наиболее чувствительным – метод подсчета клеток.

 

Тема 3. ПЕРИОДИЧЕСКОЕ ГЛУБИННОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

 

Периодическое глубинное культивирование представляет собой закрытую систему, в которой скорость роста биомассы стремится к нулю из-за исчерпания субстрата и накопления ингибиторов. Такие системы всегда находятся в неустойчивом состоянии.

Фазы роста.

1. Лаг-фаза или индукционный период начинается после посева (инокуляции) в питательную среду микроорганизма и является периодом их адаптации. Во время этой фазы происходит реорганизация микро молекулярных и макромолекулярных составных частей микробной культуры, синтез или подавление ферментов или структурных компонентов клетки. Данная фаза, в зависимости от внешних условий, может быть короткой или довольно длинной. Во время этой фазы клеточная масса может изменяться без изменения числа клеток.

2. Лаг-фаза переходит в фазу экспоненциального роста. Это - период, быстрого накопления биомассы и продуктов реакции. Описывается экспоненциальной кривой.

3. Фаза линейного роста характеризуется сбалансированностью роста в установившемся состоянии, т.е. скорость роста остается постоянной на протяжении всего процесса культивирования, а химический состав культуральной жидкости изменяется, поскольку потребляются питательные вещества и вырабатываются продукты метаболизма. Как следствие этого, окружающая микроорганизмы среда непрерывно изменяется, но скорость роста в широком диапазоне концентраций питательных веществ не зависит от них.

4. Фаза линейного роста сменяется периодом, в течение которого скорость роста культуры снижается до нуля - это фаза замедления роста.

5. Далее рост культуры может переходить в достаточно устойчивую стационарную фазу, при этом скорость гибели микроорганизмов компенсируется скоростью прироста биомассы.

6. При полном истощении питательной среды (субстрата) и значительном накоплении ингибирующих рост продуктов происходят существенные физиологические изменения культуры (лизис) и наступает так называемая фаза отмирания культуры.

Закономерности размножения микроорганизмов при периодическом культивировании. Основные положения обратимого равновесного автокаталитического роста популяции микроорганизмом можно сформулировать следующим образом:

- размножение микроорганизмов определяется протеканием двух противоположных процессов - образования и гибели клеток, т.е. синтеза и деструкции;

- скорость образования микроорганизмов (синтеза биомассы) пропорциональна все увеличивающейся в процессе их культивирования концентрации X и уменьшается с уменьшением концентрации лимитирующего субстрата S;

- скорость отмирания клеток (деструкции биомассы) пропорциональна квадрату их концентрации;

- концентрация питательных веществ, необходимых для размножения микроорганизмов, определяется содержанием в питательной среде одного или нескольких лимитирующих компонентов;

- продукты лизиса погибших клеток (Sx) в кинетическом отношении (количественно, но не качественно) эквивалентны исходному субстрату;

- процесс размножения в условиях периодического способа культивирования заканчивается установлением равновесия, при котором скорости синтеза и деструкции биомассы равны, а поэтому концентрации микроорганизмов и субстрата не меняются во времени.

Компоненты питательной среды по характеру их превращения в процессе размножения и влиянию на кинетику роста популяции можно разделить на две группы:

- вещества, которые при включении в структуру клеток и последующем лизисе погибших клеток не претерпевают изменений, и не исключают возможность их повторного использования в метаболическом обмене при образовании новых микроорганизмов;

- вещества, которые в процессе синтеза биомассы претерпевают такие превращения, что их повторное использование микроорганизмами в качестве субстрата невозможно.

Таким образом, кинетическая эквивалентность исходного субстрата и продуктов лизиса погибших клеток в реальной системе клетка-среда может иметь место, если величина субстрата связана с концентрацией в питательной среде веществ, относящихся к первой группе, что и предполагалось при построении модели обратимого равновесного автокаталитического роста популяции.

Продуктивность периодических процессов культивирования. Объемная продуктивность выражается в граммах того или иного продукта на литр среды в час (или количества микробных тел) и служит мерой общей «полезности» процесса. При периодическом процессе культивирования расчет продуктивности должен вестись на все рабочее время, в которое необходимо включать не только время собственно культивирования, но и время, необходимое для того, чтобы освободить биореактор от предыдущей загрузки, промыть его, простерилизовать, заполнить новой партией среды и снова простерилизовать эту среду с биореактором. Необходимый для этого период времени может быть как коротким (например, 6 ч при производстве дрожжей), так и довольно длинным (например. 20 ч при производстве антибиотиков).

 

БИОРЕАКТОРЫ.

 

Технологическая схема стадии культивирования микроорганизмов, отделения, концентрирования биомассы и инактивации биомассы приведена на рис.

Технологический процесс глубинного выращивания микроорганизмов в биореакторах (ферментерах) складывается из следующих типов:

1. Отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними.

2.Приготовление посевной микробной культуры.

3. Приготовление и стерилизация питательных сред.

4. Подготовка биореактора к посеву.

5. Выращивание микроорганизмов в биореакторе и контроль над процессом культивирования.

Кроме того, он включает ряд вспомогательных операций:

- стерилизацию оборудования и коммуникаций;

- приготовление и стерилизацию пеногасителей, растворов и др.

 

Биореакторы

Основным оборудованием для глубинного культивирования микроорганизмов является биореактор. Определение данного оборудования как биореактор больше соответствует его функциональному назначению - осуществление процессов биосинтеза. Основной функцией биореакторов является обеспечение условий для роста микроорганизмов, клеток животных и вирусов в заданных условиях. Следовательно, основной задачей при использовании биореакторов является обеспечение его надежности при культивировании в течение периода от нескольких часов до многих дней.

Конструкции биореакторов различны. Рабочий объем биореактора обычно не превышает 0,7 общего объема. Свободное пространство над поверхностью раствора используется как буферное, где накапливается пена и таким образом предотвращается потеря культуральной жидкости. Исследования показали, что в пенящейся жидкости условия аэрации лучше, чем в плотных растворах, при условии непрерывного перемешивания и циркуляции слоя пены, те при исключении длительного нахождения микроорганизмов вне культуральной жидкости.

Тип биореактора, металл и другие материалы, из которых он изготовлен, чистота обработки внутренних стенок аппарата и отдельных его узлов, емкость, коэффициент заполнения, поверхность теплопередачи и способ отвода тепла, тип перемешивающего и аэрирующего устройства, арматура и запорные приспособления, способ пеногашения, средства автоматизации технологических параметров процесса - вот далеко не полный перечень отдельных элементов, которые в отдельности и во взаимосвязи влияют на процесс культивирования микроорганизмов и клеток.

Хотя конструкция биореакторов для глубинного культивирования микроорганизмов и не поддается шаблону, однако можно предварительно сформулировать ряд следующих основных требований к аппаратам подобного типа:

- гомогенность культуральной среды;

- оптимальные массо- и теплообменные характеристики по потреблению питательных веществ и отводу продуктов метаболизма;

- обеспечение стерильности посева, взятия проб и процесса культивирования;

- простота наладки и обслуживания;

- стандартность блоков оборудования для культивирования;

- возможность осуществления масштабного перехода;

- возможность автоматического контроля и регулирования основных параметров культивирования.

В поисках оптимальной конструкции биореактора часто нецелесообразно останавливаться на наиболее дешевой, можно работать и на простом оборудовании, но необходимо иметь в виду, что на нем нельзя получить необходимой информации и высоких результатов.

При выборе конструкции посевного биореактора (инокулятора) следует учитывать некоторые технические требования:

- инокулятор должен быть максимально простым по конструкции и с минимальным числом штуцеров и передаточных устройств;

- в инокуляторе необходимо обеспечить оптимальные гидродинамические и массобменные условия.

Биореакторы изготавливают из высоколегированных марок сталей. Внутренняя поверхность биореактора для глубинного культивирования микроорганизмов должна быть отполирована.

Биореакторы должны быть достаточно простыми в обслуживании: работа отдельных узлов необходимо контролировать. Должны регулироваться отдельные физико-химические параметры культивирования (температура стерилизации и культивирования, рН, еН, рОг рС0₂, скорость вращения мешалки, давление, расход воздуха или газов на аэрацию, пенообразование). Соответствующая гидродинамическая обстановка в биореакторе, а следовательно и процессы тепло- и массообмена, поддерживаются с помощью специальной конструкции перемешивающих устройств, диспергаторов газа (барботеры) и наличия отражательных перегородок (отбойников). Кроме того, важное значение (особенно при масштабировании культивирования) имеют геометрические соотношения отдельных элементов биореактора.

В лабораторных и пилотных установках для глубинного культивирования часто корпус изготавливают из термостойкого и нейтрального стекла, а крышку - из нержавеющей стали с вводом через нее перемешивающего устройства, патрубков и датчиков.

Более подробно рассмотрим характеристики биореакторов, функционирующих с жидкой и газовой фазой, с механическим и барботажным диспергированием, которые часто используют для глубинного культивирования микроорганизмов при производстве биопрепаратов.

 

Инактивация вирусов

При изготовлении некоторых препаратов (вакцин) вируссодержащую суспензию подвергают инактивации. Трудности производства инактивированных вакцин заключаются в необходимости строгого контроля за полнотой инактивации вируса. Методы инактивации делят на две общие группы: физические и химические. Наиболее часто в промышленном производстве используют химические методы.

Широкое применение в качестве инактивирующего агента получил формальдегид; для производства противоящурных вакцин во всем мире широко применяются азиридины; для инактивации вирусов ящура, болезни Ньюкасла, бешенства энцефалитов лошадей и др. используют β-пропиопактон.

Поскольку инактивирующие агенты легко реагируют с невирусными белками и некоторыми компонентами питательных сред, при выборе концентрации инактиванта необходимо учитывать степень чистоты препарата.

Физические инактивирующие агенты имеют ограниченное применение: ультрафиолетовый свет и ионизирующая радиация инактивируют нуклеиновые кислоты вирусов, при их применении необходимо учитывать, что повышение дозы облучения ведет к снижению антигеннности препарата. Тепловое воздействие на вирусы в целях уничтожения их инфекционности при сохранении иммуногенности также ограничено. Температура часто играет роль критического фактора при инактивации вирусов с применением химических средств.

 

Производства

Процесс изготовления вирусных препаратов должен быть изложен в инструкциях (регламент производства); подробно описывающих каждую стадию технологической цепочки. На каждую серию препарата составляется специальный протокол, в котором указываются все данные об изготовлении и контроле препарата.

На отдельных этапах производства контролируется качество продукции по параметрам, предусмотренным действующей нормативной документацией. При этом проверяется выполнение правил использования сырья, качество полуфабриката, соблюдение технологических режимов работы, санитарное состояние цехов и рабочих мест.

При контроле препаратов должны использоваться референс-материалы, представляющие собой стандартные образцы свойств и состава препаратов. На предприятии проводится двухступенчатый контроль каждой серии препарата.

На первой ступени операционный контроль промежуточных продуктов и готовых препаратов осуществляется непосредственно персоналом, производящим препарат, в специально предназначенном для этой цели помещении.

На второй ступени препарат контролируется в отделе биологического и технологического контроля (ОБТК) предприятия. При ОБТК находится музей юридических образцов серий препаратов, отправленных предприятием потребителю. Образцы в объеме, достаточном для проведения полного контроля, предназначены для повторного контроля препарата в случае рекламации, в случае несоответствия результатов контроля ВГНКИ требованиям нормативной документации и в случае необходимости наблюдения за изменением качества препаратов в процессе их хранения.

Таблица 3.

Пробиотики на основе бактерий рода Bacillus

Препарат	Микроорганизм	Страна-производитель
Медицинские
Споробактерин	B.subtilis	Россия I
Бактиспорин	B.subtilis	Россия
Биоспорин	B.subtilis, B.licheniformis	Украина
Гинеспорин	B.subtilis	Украина
Энтерогермин	B.subtilis	Италия
Флонивин	B.subtilis	Югославия
Бактисубтил	B.cereus	Франция
Цереобиоген	B.cereus	Китай
Ветеринарные
Энтеробактерин	B.subtilis	Россия
Биод-5	B.subtilis, B.licheniformis	Россия
Бактерин-СЛ	B.subtilis, B.licheniformis	Украина
Эвдоспорин	B.subtilis	Украина
БПС-44	B.subtilis	Украина
Глоген-8	B.natto	США
Прималас	B.subtilis	Нидерланды
ГГротексин	B.subtilis	Нидерланды

Важнейшими свойствами некоторых штаммов бацилл являются: антагонистическая активность ко многим патогенным и условно патогенным микроорганизмам; высокая ферментативная активность, позволяющая существенно регулировать и стимулировать пищеварение; противоаллергенное и антитоксическое действия и ряд других.

Биоспорин применяется для коррекции нарушений микрофлоры кишечника человека, вызванной нерациональным применением антибиотиков, нарушением питания, перенесенными инфекционными заболеваниями, для профилактики и лечения острых кишечных инфекций. Однако установлено, что спектр показаний для применения пробиотиков в клинической практике может быть существенно расширен. Так, выявлены их позитивные эффекты при лечении ревматоидного артрита, некоторых инфекций мочеполовых путей, гнойно-воспалительных осложнений в хирургической практике, гинекологических заболеваниях инфекционной природы и многих других.

Биод-5 - новый пробиотик ветеринарного назначения, разработанный сотрудниками кафедры биотехнологии МГАВМиБ имени Скрябина, включает два штамма бацилл - B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11.

Препарат предназначен для лечения животных, больных острыми кишечными инфекциями, вызванных сальмонеллами, шигеллами, стафилококками и другими патогенными микроорганизмами, для восстановления нормальной микрофлоры кишечника.

Технология предусматривает раздельное культивирование B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11 и смешивание их после стадии концентрирования в соотношении 3:1.

 

 

Схема технологического процесса производства Биод-5.

Одним из перспективных направлений разработки новых биопрепаратов является создание пробиотиков на основе микроорганизмов и заданными свойствами, полученными методами генной инженерии. Первый такой пробиотик медицинскогр назначения Субалин, наряду с высокой антибактериальной активностью в отношении широкого спектра патогенных микроорганизмов, характеризуется антивирусными свойствами. Этот препарат разработан в Институте микробиологии им. ДЛС Заболотного НАН Украины совместно с НПО «Вектор» (Россия) ив настоящее время проходит с успехом клинические испытания.

Создание пробиотиков и их широкое применение являются сегодня стратегическим направлением в борьбе со многими инфекционными заболеваниями человека и животных.

 

ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Особое место в современной биотехнологии занимает биотехнология микробных ферментов - область, которая охватывает круг вопросов от отбора и селекции микроорганизмов-продуцентов ферментов до получения готовых препаратов и их использования.

Наука о ферментах называется энзимологией. Термины «фермент» и «энзим» давно используют как синонимы (первый, в основном, в русской и немецкой научной литературе, второй - в англоязычной). А более ста лет назад эти термины отражали различные точки зрения в теоретическом споре Л. Пастера и Ю. Либиха о природе спиртового брожения. Ферментами (от лат. fermentum - закваска) называли «организованные ферменты» (т.е. сами живые микроорганизмы), а термин энзим (от греч. en - в и zyme - закваска) был предложен» 1876 г. В. Кюне для «неорганизованных ферментов», секретируемых клетками желудка или кишечника. Через два года после смерти Л. Пастера (1897) Э.Бюхнер опубликовал работу «Спиртовое брожение без дрожжевых клеток», в которой экспериментально показал, что бесклеточный дрожжевой сок осуществляет спиртовое брожение гак же, как и не разрушенные дрожжевые клетки. В 1907 г. за эту работу он был удостоен Нобелевской премии.

В настоящее время учение о ферментах превратилось в интенсивно развивающуюся область знаний. Российские ученые В.А. Энгельгардт, А.Е. Браунштейн, СР. Мардашев, И.В. Березин и др. внесли крупный вклад в мировую науку в области изучения структуры и функций ферментов, механизмов энзиматического катализа и регуляции активности и синтеза ферментов. Это способствовало существенному улучшению методов диагностики, лечения и профилактики болезней человека и животных.

Основной функцией ферментов является их способность резко повышать (в десятки и сотни млрд. раз) скорость химических реакций, осуществляемых ежесекундно во всех живых системах. Более того, ферменты являются регуляторами скорости химических реакций, строго контролируя процессы синтеза и распада индивидуальных химических компонентов клетки и всего организма в целом. Благодаря этому свойству ферментов живые системы сохраняют постоянство внутренней среды (гомеостаз). Ферменты выполняют важные функции, обезвреживая как экзогенные, так и эндогенные токсические вещества; последние под действием ферментов подвергаются различным реакциям окисления, восстановления и, наконец, распада на продукты, теряющие свои токсические свойства. Эта область исследования получила название ксенобиохимия.

Кроме того, ферменты используются в качестве инструментов для осуществления тонкого химического органического синтеза в легкой, пищевой, микробиологической и фармацевтической промышленностях (производство кормового белка, гормонов, антибиотиков и других лекарственных препаратов и аминокислот), а также в генно-инженерных исследованиях и биотехнологии.

К настоящему времени получены убедительные доказательства, что современная биология и медицина говорят на языке энзимологии и что возможности применения ферментов теоретически безграничны. В частности, четко определились три основных направления Исследований в области энзимологии: энзимопатология, энзимодиагностика и энзимотерапия.

Область исследования энзимопатологии призвана изучать молекулярные основы развития патологического процесса, основанного на нарушениях механизмов регуляции активности или синтеза индивидуального фермента или группы ферментов.

Другое направление научных исследований в области энзимологии -энзимодиагностика - призвано заниматься разработкой ферментных тестов, основанных на определении активности (уровня) ферментов и изоферментов в биологических жидкостях макроорганизма (сыворотка крови, желудочный или дуоденальный сок, моча и др.). Эти исследования развиваются в двух направлениях: во-первых, по пути поиска органотропных или тканетропных ферментов, специфичных для определенного органа, группы органов или целостного организма; во-вторых, по пути совершенствования уже известных методов определения активности ферментов в биосредах. Диагностическая энзимология достигла огромных успехов, помогая врачу не только в постановке правильного диагноза заболевания и выяснения степени тяжести болезни, но и в выборе правильного метода лечения. В настоящее время разработаны количественные методы анализа многих распространенных ферментов, выявляемых в биологических жидкостях при поражении разных органов. Для каждого из этих ферментов определены контрольные величины (уровни) активности и пределы колебания в норме как в сыворотке крови, так и в самом органе.

Диагностическая ценность ферментов существенно повысилась после внедрения в клиническую практику методов определения изоферментов, различающихся электрофоретической подвижностью, хотя и наделенных одинаковой биологической активностью.

Обладая высокой специфичностью действия, ферменты применяются также в качестве самых тонких и избирательных инструментов в направленном воздействии на течение любой патологии, т.е. в качестве эффективных лечебных препаратов (энзимотерапия) при инфекционных, незаразных и наследственных заболеваниях.

Основные источники ферментов - ткани и органы животных, растения и микроорганизмы.

По экономическим и технологическим соображениям получать ферменты с помощью микроорганизмов более выгодно, чем из растительных и животных источников. Микробные клетки содержат или продуцируют более двух тысяч видов ферментов, которые катализируют биохимические реакции, связанные с ростом, дыханием и образованием продуктов. Многие из этих ферментов могут быть легко выделены, после чего они проявляют свою активность независимо от клетки.

Номенклатура ферментных препаратов, производимых путем микробиологического синтеза, постоянно расширяется, а масштабы производства микробных ферментов на основе дешевого сырья практически не ограничены.

Высокоочищенные ферменты — одна из важных групп биохимических реактивов, без которых невозможно проведение научно-исследовательских работ в области молекулярной биологии и генной инженерии. Кроме того, эти препараты входят в различные диагностические наборы, предназначенные для серийных анализов.

На сегодняшний день самыми крупными производителями ферментов являются США, Япония и Франция.

В США ферменты производят более 20 фирм, которые ежегодно выпускают свыше 32000 т ферментных препаратов.

В Японии в 1997 г. было выработано более 56000 т ферментных препаратов 60 наименований. Из этого количества для пищевой пропромышленности предназначалось около 26%, текстильной - 23% и сельского хозяйства - 38%, остальные - для разных потребителей, одним из которых в последние годы стали предприятия химической чистки одежды.

В России расширяется выпуск ферментов разных наименований. Основными сферами их использования являются пищевая, мясная, текстильная, кожевенная промышленность и сельское хозяйство.

Применение ферментных препаратов в указанных отраслях промышленности во много раз ускоряет производственные процессы, обеспечивает более экономичное использование сельскохозяйственного сырья, увеличивает выход продукции высокого качества. При этом достигаются существенное снижение себестоимости продукции и улучшение показателей использования основных фондов и оборотных средств.

Так, например, обработка ферментными препаратами мяса позволяет увеличить выход высших сортов с 13 - 15 до 25 - 27% от его общего веса. Применение ферментов в кожевенной промышленности в 5 раз сокращает длительность процессов очистки, обезвоживания и смягчения кожи, на 25 -30 % увеличивает выход шерсти и улучшает ее качество. Добавка ферментных препаратов в корма для животных в количестве 0,01 - 0,03 % от сухого вещества рациона увеличивает привесы скота на 5 - 10%, птицы - на 10-20 %. Затраты кормов на получение единицы привеса снижаются при этом на 6 - 12%.

Предприятия РФ выпускают ряд технических ферментных препаратов: амилосубтилин и протосубтилин (Bacillus subtilis), пектофоетидин (Aspergillus foetidus), мальтаваморин (Aspergillus awamori), амилоризин (Aspergillus oryzae), глюконигрин (Aspergillus niger), протолихенин (Bacillus licheniformis). Это комплексные ферментные препараты, из которых можно выделить в высокоочищенном состоянии основной фермент, а иногда и один-два сопутствующих. Однако количество полученных таким образом ферментов в настоящее время не превышает десяти (нейтральная и щелочная протеазы, альфа-амилаза, глюкоамилаза, пектиназа, целлюлаза и др.). Это внеклеточные ферменты. Для получения высокоочищенных внутриклеточных ферментов данный способ непригоден. Возможен только направленный биосинтез целевого фермента отобранным штаммом-продуцентом с последующим целенаправленным его выделением различными описанными ниже методами.

О степени концентрирования и очистки ферментного препарат свидетельствует цифра в его наименовании, стоящая перед индексом «х». Индекс «2х» означает, что препараты ферментов получены и виде концентрированных сиропов, освобожденных от нерастворимых веществ. Сухие ферментные препараты имеют в наименовании индекс «Зх». Ферментные препараты с индексами «2х» и «Зх» относятся к техническим.

Препараты ферментов, очищенные различными методами, обозначаются индексом «10х», а фракционированные - «15х». Высокоочищенные, но не кристаллические ферментные препараты, которые содержат до 25 % балластных веществ и получены методом концентрирования на ультра фильтрационных установках с последующей сушкой в распылительных сушилках, в зависимости от степени очистки обозначаются индексами «20х» и «З0х». Например, название препарата «протосубтилин Г20х» означает, что он содержит протеолитические ферменты, полученные при глубинном культивировании культуры Bacillus subtilis, очищен, сконцентрирован ультрафильтрацией и высушен в распылительной сушилке.

Штаммы - продуценты ферментов. Биологический процесс, связанный с получением любого промышленного продукта, должен разрабатываться, как минимум, с учетом двух обстоятельств. Во-первых, должен существовать спрос на данный продукт. Во-вторых, внедрение процесса должно быть экономически выгодно.

При наличии потенциального спроса и подходящего источника получения фермента главной задачей, которую необходимо решить, становится повышение эффективности технологии получения фермента таким образом, чтобы его производство и последующая реализация оказались экономически выгодными.

Получение ферментов в промышленных масштабах производится из биологических объектов всех видов. Однако признано, что лучшими, источниками для получения ферментов являются микроорганизмы. Это подтверждается следующими факторами:

- современные подходы к селекции микробных культур (первичная селекция, мутация, генная инженерия) и оптимизации условий культивирования дают возможность значительно увеличить биосинтез практически любого микробного фермента;

- используемый в промышленных условиях штамм-продуцент должен иметь такую систему регуляции синтеза фермента, которая позволяет накапливать его в количествах, значительно превосходящих физиологическую потребность микроорганиз