Тема 7. Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах

 

Начало применения развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) для выращивания вирусов приходится на 1928 - 35 гг. Этот период австралийский ученый Бернет назвал «первой золотой эпохой» развития вирусологии, поскольку она открыла возможность культивирования вирусов на довольно удобной живой лабораторной модели, как правило, интактной в отношении многих возбудителей инфекционных болезней. По сути, это был первый биотехнологический процесс накопления вирусов, пригодный для промышленного и массового производства противовирусных вакцин.

РКЭ являются универсальным и простым для манипуляций объектом. Это обусловлено тем, что куриный эмбрион содержит четыре различных естественных питательных субстрата для накопления вирусов: амниониотическую и аллантоисную жидкость, хорионаллантоисную оболочку (ХАО) и желточный мешок, клетки которых, как клетки самого эмбриона, являются высокочувствительными к различным вирусам. Вследствие этого куриные эмбрионы пригодны для выделения вирусов из патологического материала, получения антигенов, определения титров инфекционности вирусов, постановки реакции нейтрализации и так далее. В силу высокой производительности РКЭ используют для получения вакцин против ряда болезней животных и человека.

Для получения РКЭ используют яйца от белых леггорнов, имеющие тонкую скорлупу. Они должны быть снесены не позднее десяти суток назад. В противном случае развитие зародыша, несмотря на оплодотворение, сильно задерживается. Яйца должны быть чистыми, но не мытыми.

Инкубацию проводят в обычных инкубаторах с автоматическим приспособлением для переворачивания яиц, вентилятором, термометром и гигрометром, при температуре 37,2 - 37,8 °С и влажности 60 -70%. Возраст РКЭ, используемых для работы, зависит от вида вируса, которым будут заражать куриные эмбрионы. Однако независимо от этого яйца нужно овоскопировать на 3-4 сут инкубации, для того чтобы удалить неоплодотворенные (болтуны) и яйца с погибшими эмбрионами.

Дальнейшее развитие эмбрионов проводят с соблюдением вышеуказанных условий. Обычно развивающиеся куриные эмбрионы заражают в возрасте 7-12 сут.

Работу по заражению РКЭ проводят в стерильном боксе, где имеются рабочие столы, стулья, куда подведены вода, газ, вакуум. Перед началом работы стол дезинфицируют. Заранее готовят необходимые инструменты, дезинфицирующий раствор, йодированный спирт, пробойник для вскрытия скорлупы.

Заражение эмбрионов проводят с помощью стерильных специальных шприцов и игл. Здесь должен быть расплавленный парафин для заливки отверстий в скорлупе после заражения. Кроме того, необходима емкость с дезинфицирующей жидкостью для использованного инструмента. В боксе должна иметься специальная подставка для яиц. Вне зависимости от патогенности используемых вирусов работа производится в масках, защитных очках, резиновых перчатках или в специальных костюмах для стерильных помещений. Подготовленный таким образом бокс облучают в течение 1 - 2 ч до начала работы УФ - светом.

В настоящее время согласно международным требованиям (GMP) работу вируссодержащим материалом проводят в ламинарных боксах, обеспеченных избыточным поддувом стерильного воздуха, прошедшего через мембранные фильтры.

Перед заражением РКЭ просвечивают с целью определения жизнеспособности эмбриона и удаляют погибшие эмбрионы. При необходимости делают разметку места заражения эмбрионов.

Заражение РКЭ проводят заранее подготовленным вирусом в определенном титре. Чтобы иметь стерильную (свободную от бактерий) суспензию вируса к инокулируемому вирусному материалу добавляют по 100 -1000 мг стрептомицина и 100 - 1000 ЕД пенициллина.

Заражение в аллантоисную полость осуществляют на 10-11-суточными куриных эмбрионах. При этом яйцо фиксируют тупым концом вверх, отметив предварительно границу воздушной камеры (пути) и расположение эмбриона. В области воздушной камеры скорлупу дезинфицируют иодированным спиртом и прожигают. Потом прокалывают ее зондом и в образовавшееся отверстие вносят 0,1 - 0,2 мл инокулированной жидкости с оттитрованным вирусом. При этом инъекционную иглу вводят на 1 - 2 мм ниже границы пуги. После заражения эмбриона отверстие в скорлупе заливают парафином и яйцо помещают в инкубатор.

Заражение в амнион проводят на 8 - 9-суточных эмбрионах. Иглу от шприца вводят через отверстие в скорлупе со стороны пуги (под контролем осветительной лампы) до места предлежания эмбриона, отмеченное ранее крестиком. Перед введением вируса в амнион иглу необходимо поджигать. Если эмбрион повторяет движения иглы, то, следовательно, игла попала в амнион. Доза заражения в амнион также составляет 0,1-0,2 мл вирусной суспензии. После заражения отверстие в скорлупе заливают парафином и продолжают инкубировать.

Заражение на ХАО осуществляют на 10 - 12-суточных эмбрионах. Этот способ требует особой осторожности, так как не допускаются травмирования как самой ХАО, так и подскорлуповой пленки. Отверстие в скорлупе делают в том месте, где нет кровеносных сосудов (под контролем лампы) и с помощью шприца и иглы вводят 0,1-0,2 мл вирусной суспензии. Если возникло кровотечение, то яйцо выбраковывают. Отверстие в скорлупе заливают парафином и продолжают инкубировать.

Заражение в желточный мешок проводят на 5 - 7-суточных эмбрионах. Иглу вводят до упора в скорлупу. Отверстие в скорлупе заливают парафином и продолжают инкубировать.

После заражения ежедневно эмбрионы контролируют на патогенное действие вируса. Для этого их подвергают овоскопии. Яйца с погибшими эмбрионами выбраковывают, а для получения вируса без эритроцитов, на которых он может адсорбироваться, эмбрионы умершвляют путем выдержки яйца в течение 10 - 12 ч при 4 °С.

Следует заметить, что при производстве противовирусных вакцин методы заражения куриных эмбрионов в амнион и желточный мешок применяют редко из-за их трудоемкости и недостаточной производительности.

В промышленных условиях на биопредприятиях при объемном производстве антигенов и противовирусных вакцин наиболее часто применяют метод заражения куриных эмбрионов в аллантоисную полость на ХАО. Поэтому мы наиболее подробно изложим технологию получения вирусного материала из РКЭ, зараженных в аллантоисную полость.

Перед получением вируса скорлупу над воздушной камерой дезинфицируют и отделяют ее ножницами или пинцетом. Нижнюю пленку подскорлуповой оболочки, формирующую пугу, и хорионаллантоисную оболочку прокалывают и отсасывают пипеткой или с помощью специального аппарата аллантоисную жидкость.

Из одного эмбриона, в зависимости от его возраста, можно собрать до 8 -10 см аллантоисной жидкости. Аллантоисную жидкость можно получить без эритроцитов, подвергнув ее центрифугированию при 3000 об/мин в течение 20 -30 мин.

После получения аллантоисной жидкости ее проверяют на стерильность путем высевов на питательные среды, а также на содержание вируса и его количества путем титрования в какой-либо иммунологической реакции (например, в реакции гемагглютинации).

Способ культивирования вирусов в аллантоисной полости куриных эмбрионов в биопромышленности используют при получении антигенов для диагностики гриппозных инфекций у людей, лошадей, птиц, а также для получения живых и инактивированных вакцин против гриппа у людей, животных и птиц, болезни Ньюкасла птиц из штамма «Н», инфекционного ларинготрахеита птиц и др.

В ряде случаев живые вакцины готовят из вирусов, выращенных на ХАО куриных эмбрионов (например, сухая эмбрион-вакцина из голубиного вируса против оспы птиц). Для получения вирусного материала в таком случае яйцо разрезают вдоль до конца воздушной камеры. Эмбрион, желточный мешок и белок удаляют, а хорионаллантоисную оболочку собирают пинцетом, переносят в сосуд для промывания в растворе Хенкса. При просмотре ХАО на темном фоне можно хорошо видеть множество очагов некроза, число которых указывает на степень размножения вирусов