Тема 17. Технология приготовления и использование

ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Особое место в современной биотехнологии занимает биотехнология микробных ферментов - область, которая охватывает круг вопросов от отбора и селекции микроорганизмов-продуцентов ферментов до получения готовых препаратов и их использования.

Наука о ферментах называется энзимологией. Термины «фермент» и «энзим» давно используют как синонимы (первый, в основном, в русской и немецкой научной литературе, второй - в англоязычной). А более ста лет назад эти термины отражали различные точки зрения в теоретическом споре Л. Пастера и Ю. Либиха о природе спиртового брожения. Ферментами (от лат. fermentum - закваска) называли «организованные ферменты» (т.е. сами живые микроорганизмы), а термин энзим (от греч. en - в и zyme - закваска) был предложен» 1876 г. В. Кюне для «неорганизованных ферментов», секретируемых клетками желудка или кишечника. Через два года после смерти Л. Пастера (1897) Э.Бюхнер опубликовал работу «Спиртовое брожение без дрожжевых клеток», в которой экспериментально показал, что бесклеточный дрожжевой сок осуществляет спиртовое брожение гак же, как и не разрушенные дрожжевые клетки. В 1907 г. за эту работу он был удостоен Нобелевской премии.

В настоящее время учение о ферментах превратилось в интенсивно развивающуюся область знаний. Российские ученые В.А. Энгельгардт, А.Е. Браунштейн, СР. Мардашев, И.В. Березин и др. внесли крупный вклад в мировую науку в области изучения структуры и функций ферментов, механизмов энзиматического катализа и регуляции активности и синтеза ферментов. Это способствовало существенному улучшению методов диагностики, лечения и профилактики болезней человека и животных.

Основной функцией ферментов является их способность резко повышать (в десятки и сотни млрд. раз) скорость химических реакций, осуществляемых ежесекундно во всех живых системах. Более того, ферменты являются регуляторами скорости химических реакций, строго контролируя процессы синтеза и распада индивидуальных химических компонентов клетки и всего организма в целом. Благодаря этому свойству ферментов живые системы сохраняют постоянство внутренней среды (гомеостаз). Ферменты выполняют важные функции, обезвреживая как экзогенные, так и эндогенные токсические вещества; последние под действием ферментов подвергаются различным реакциям окисления, восстановления и, наконец, распада на продукты, теряющие свои токсические свойства. Эта область исследования получила название ксенобиохимия.

Кроме того, ферменты используются в качестве инструментов для осуществления тонкого химического органического синтеза в легкой, пищевой, микробиологической и фармацевтической промышленностях (производство кормового белка, гормонов, антибиотиков и других лекарственных препаратов и аминокислот), а также в генно-инженерных исследованиях и биотехнологии.

К настоящему времени получены убедительные доказательства, что современная биология и медицина говорят на языке энзимологии и что возможности применения ферментов теоретически безграничны. В частности, четко определились три основных направления Исследований в области энзимологии: энзимопатология, энзимодиагностика и энзимотерапия.

Область исследования энзимопатологии призвана изучать молекулярные основы развития патологического процесса, основанного на нарушениях механизмов регуляции активности или синтеза индивидуального фермента или группы ферментов.

Другое направление научных исследований в области энзимологии -энзимодиагностика - призвано заниматься разработкой ферментных тестов, основанных на определении активности (уровня) ферментов и изоферментов в биологических жидкостях макроорганизма (сыворотка крови, желудочный или дуоденальный сок, моча и др.). Эти исследования развиваются в двух направлениях: во-первых, по пути поиска органотропных или тканетропных ферментов, специфичных для определенного органа, группы органов или целостного организма; во-вторых, по пути совершенствования уже известных методов определения активности ферментов в биосредах. Диагностическая энзимология достигла огромных успехов, помогая врачу не только в постановке правильного диагноза заболевания и выяснения степени тяжести болезни, но и в выборе правильного метода лечения. В настоящее время разработаны количественные методы анализа многих распространенных ферментов, выявляемых в биологических жидкостях при поражении разных органов. Для каждого из этих ферментов определены контрольные величины (уровни) активности и пределы колебания в норме как в сыворотке крови, так и в самом органе.

Диагностическая ценность ферментов существенно повысилась после внедрения в клиническую практику методов определения изоферментов, различающихся электрофоретической подвижностью, хотя и наделенных одинаковой биологической активностью.

Обладая высокой специфичностью действия, ферменты применяются также в качестве самых тонких и избирательных инструментов в направленном воздействии на течение любой патологии, т.е. в качестве эффективных лечебных препаратов (энзимотерапия) при инфекционных, незаразных и наследственных заболеваниях.

Основные источники ферментов - ткани и органы животных, растения и микроорганизмы.

По экономическим и технологическим соображениям получать ферменты с помощью микроорганизмов более выгодно, чем из растительных и животных источников. Микробные клетки содержат или продуцируют более двух тысяч видов ферментов, которые катализируют биохимические реакции, связанные с ростом, дыханием и образованием продуктов. Многие из этих ферментов могут быть легко выделены, после чего они проявляют свою активность независимо от клетки.

Номенклатура ферментных препаратов, производимых путем микробиологического синтеза, постоянно расширяется, а масштабы производства микробных ферментов на основе дешевого сырья практически не ограничены.

Высокоочищенные ферменты — одна из важных групп биохимических реактивов, без которых невозможно проведение научно-исследовательских работ в области молекулярной биологии и генной инженерии. Кроме того, эти препараты входят в различные диагностические наборы, предназначенные для серийных анализов.

На сегодняшний день самыми крупными производителями ферментов являются США, Япония и Франция.

В США ферменты производят более 20 фирм, которые ежегодно выпускают свыше 32000 т ферментных препаратов.

В Японии в 1997 г. было выработано более 56000 т ферментных препаратов 60 наименований. Из этого количества для пищевой пропромышленности предназначалось около 26%, текстильной - 23% и сельского хозяйства - 38%, остальные - для разных потребителей, одним из которых в последние годы стали предприятия химической чистки одежды.

В России расширяется выпуск ферментов разных наименований. Основными сферами их использования являются пищевая, мясная, текстильная, кожевенная промышленность и сельское хозяйство.

Применение ферментных препаратов в указанных отраслях промышленности во много раз ускоряет производственные процессы, обеспечивает более экономичное использование сельскохозяйственного сырья, увеличивает выход продукции высокого качества. При этом достигаются существенное снижение себестоимости продукции и улучшение показателей использования основных фондов и оборотных средств.

Так, например, обработка ферментными препаратами мяса позволяет увеличить выход высших сортов с 13 - 15 до 25 - 27% от его общего веса. Применение ферментов в кожевенной промышленности в 5 раз сокращает длительность процессов очистки, обезвоживания и смягчения кожи, на 25 -30 % увеличивает выход шерсти и улучшает ее качество. Добавка ферментных препаратов в корма для животных в количестве 0,01 - 0,03 % от сухого вещества рациона увеличивает привесы скота на 5 - 10%, птицы - на 10-20 %. Затраты кормов на получение единицы привеса снижаются при этом на 6 - 12%.

Предприятия РФ выпускают ряд технических ферментных препаратов: амилосубтилин и протосубтилин (Bacillus subtilis), пектофоетидин (Aspergillus foetidus), мальтаваморин (Aspergillus awamori), амилоризин (Aspergillus oryzae), глюконигрин (Aspergillus niger), протолихенин (Bacillus licheniformis). Это комплексные ферментные препараты, из которых можно выделить в высокоочищенном состоянии основной фермент, а иногда и один-два сопутствующих. Однако количество полученных таким образом ферментов в настоящее время не превышает десяти (нейтральная и щелочная протеазы, альфа-амилаза, глюкоамилаза, пектиназа, целлюлаза и др.). Это внеклеточные ферменты. Для получения высокоочищенных внутриклеточных ферментов данный способ непригоден. Возможен только направленный биосинтез целевого фермента отобранным штаммом-продуцентом с последующим целенаправленным его выделением различными описанными ниже методами.

О степени концентрирования и очистки ферментного препарат свидетельствует цифра в его наименовании, стоящая перед индексом «х». Индекс «2х» означает, что препараты ферментов получены и виде концентрированных сиропов, освобожденных от нерастворимых веществ. Сухие ферментные препараты имеют в наименовании индекс «Зх». Ферментные препараты с индексами «2х» и «Зх» относятся к техническим.

Препараты ферментов, очищенные различными методами, обозначаются индексом «10х», а фракционированные - «15х». Высокоочищенные, но не кристаллические ферментные препараты, которые содержат до 25 % балластных веществ и получены методом концентрирования на ультра фильтрационных установках с последующей сушкой в распылительных сушилках, в зависимости от степени очистки обозначаются индексами «20х» и «З0х». Например, название препарата «протосубтилин Г20х» означает, что он содержит протеолитические ферменты, полученные при глубинном культивировании культуры Bacillus subtilis, очищен, сконцентрирован ультрафильтрацией и высушен в распылительной сушилке.

Штаммы - продуценты ферментов. Биологический процесс, связанный с получением любого промышленного продукта, должен разрабатываться, как минимум, с учетом двух обстоятельств. Во-первых, должен существовать спрос на данный продукт. Во-вторых, внедрение процесса должно быть экономически выгодно.

При наличии потенциального спроса и подходящего источника получения фермента главной задачей, которую необходимо решить, становится повышение эффективности технологии получения фермента таким образом, чтобы его производство и последующая реализация оказались экономически выгодными.

Получение ферментов в промышленных масштабах производится из биологических объектов всех видов. Однако признано, что лучшими, источниками для получения ферментов являются микроорганизмы. Это подтверждается следующими факторами:

- современные подходы к селекции микробных культур (первичная селекция, мутация, генная инженерия) и оптимизации условий культивирования дают возможность значительно увеличить биосинтез практически любого микробного фермента;

- используемый в промышленных условиях штамм-продуцент должен иметь такую систему регуляции синтеза фермента, которая позволяет накапливать его в количествах, значительно превосходящих физиологическую потребность микроорганизма;

- исключено влияние фактора сезонности на процесс культивирования микроорганизмов;

-для культур микроорганизмов - представителей разных таксономических групп характерен широкий спектр биосинтеза ферментов. Уникальное многообразие самих микроорганизмов, с учетом использования методов генной инженерии, создает идеальную возможность отбора ферментов практически для всех конкретных технологий или других целей;

-возможно получение ферментов с особенными каталитическими
свойствами (белковая инженерия). Это имеет большое значение при
использовании ферментов в промышленных процессах, но особенно
эффективно может быть в медицинской и ветеринарной практике.

Среди микроорганизмов-продуцентов ферментов практический интерес представляют микроскопические грибы родов Aspergillus, Rhizopus, Penicillium, бактерии рода Bacillus, дрожжи рода Saccharomyces и др., однако получение промышленных культур-продуцентов является сложным и долгим процессом.

Использование методов генной и клеточной инженерии открывает новые возможности микроорганизмов как продуцентов ферментов.

Усиление признака биосинтеза ферментов микроорганизмами или приобретение способности синтеза ферментов с новыми, уникальными свойствами возможны благодаря клонированию соответствующих генов. С этой целью широко используются такие генетически хорошо изученные организмы, как Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus oryzae, Phanerochaetu chriso-sporium и др.

Промышленная культура микроорганизма-продуцента ферментов должна характеризоваться следующими свойствами:

-способностью накапливать много ферментов (в клетке или
культуральной жидкости) на дешевой питательной среде в больших
емкостях;

-не проявлять токсические и патогенные свойства в промышленных
условиях культивирования;

-характеризоваться стабильностью образуемого фермента или,
наоборот, лабильностью, в зависимости от условий его последующего
использования;

-обладать конститутивным механизмом синтеза основного фермента;

-максимально уменьшать время культивирования и доводить до
минимума ингибирующее действие метаболитов на активность фермента.

Вышеприведенные характеристики для промышленно важных культур не являются исчерпывающими, поскольку каждый конкретный штамм имеет свойственные ему особенности.

По мнению специалистов, процент качественно различающихся микроорганизмов - представителей разных таксономических групп, известных микробиологам, не превышает 30-40 %, а это значит, что существуют ферменты и метаболические пути, неизвестные биохимикам. Несомненно выделение этих культур и их тщательная физиолого-биохимическая характеристика могут существенно обогатить арсенал имеющихся ферментов. С этой точки зрения особенно интересны ферменты микроорганизмов, имеющих оптимум роста и развития в экстремальных для обычных форм (мезофильных культур) условиях, в частности, термофилы, ацидофилы, алкалифилы, психрофилы, галофилы, барофилы. К этой же группе микроорганизмов могут быть отнесены и те автотрофные формы, которые для синтеза ряда метаболитов растут на крайне бедных по химическому составу средах, например, базидиальные грибы, образующие лигнинокисляющие ферменты.

Первый этап при выборе продуцентов ферментов - выделение их из природных источников (образцов почв, воды, различных биологических материалов и др.) и/или скрининг коллекционных штаммов. Вначале изыскивают микроорганизмы, которые потенциально обладают полезными свойствами.

 

 

Установление таксономической принадлежности, рода и вида культуры. Физиолого-биохимическая характеристика. Выявление патогенности и токсичности. Установление признака наличия интересующего фермента.

Получение мутанта, трансформанта на основе селективно отобранных культур с увеличенной активностью интересующего фермента и установление генетической стабильности полученных штаммов.

Подбор состава питательной среды и установление специфики синтеза фермента: внутриклеточной, внеклеточной, локализованный в клеточных структурах и т.д.

Подбор типа (поверхностный, глубинный, периодический, непрерывный) и условий культивирования (температура, рН среды, парциальное давление и т.д.)

Масштабирование процесса выращивания

Последовательность этапов выделения и обработки культуры микроорганизма из природного источника для получения промышленных штаммов продуцентов ферментов

 

Профезим представляет собой пролонгированный ферментный препарат, способный длительно гидролизовать денатурированные белки, не снижая при этом своей протеолитической активности.

Препарат профезим выпускается в виде 10 % взвеси желтого с коричневым оттенком цвета, в герметически закрытых флаконах по 10 мл. Хранится при температуре 4 - 8 °С.

Профезим оказывает некролитический, противоотечный и противовоспалительный эффекты, стимулирует регенерационные процессы, ускоряет рост и созревание грануляционной ткани. Не оказывает токсического или местнораздражающего действия, не всасывается в кровь и не вызывает аллергических реакций, сокращает сроки заживления ран.

В ветеринарной практике препарат применяют для лечения острых гнойно-некротических процессов различной этиологии, гнойных ран после вскрытия абсцессов и флегмон, инфицированных ран и послеоперационных осложнений, некротических пододермитов, некробактериоза в стадии изъязвления, ожогов, а также длительно не заживающих ран у сельскохозяйственных, домашних и лабораторных животных. Профезим может применяться также при лечении острых и хронических эндометритов крупного рогатого скота.

Террилин - препарат протеолитического действия, являющийся продуктом жизнедеятельности плесневого гриба Aspergillus terricola.

Препарат выпускают в виде пористой массы или порошка белого или белого с желтоватым оттенком цвета. Легко растворим в воде и изотоническом растворе натрия хлорида, растворим в 0,25 % растворе новокаина. Практически нерастворим в спирте.

Активность препарата выражается в протеолитических единицах (ПЕ); 1 мг препарата должен содержать не менее 2 ПЕ.

Применяют террилитин для лечения гнойных ран, ожогов, трофических язв, пролежней, воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей (трахеита, бронхита, пневмонии, абсцесса легких и ряда других заболеваний, которые сопровождаются накоплением густого вязкого экссудата). Для лечения гнойных ран, ожогов, пролежней террилитин применяют местно в виде раствора, содержащего в 1 мл 40 - 50 ПЕ.

Терридеказа - продукт присоединения террилитина к окисленному полиглюкину. Пористая масса или лиофилизированный порошок белого с желтоватым оттенком цвета. Применяют наружно для лечения гнойных ран.

Ируксол (коллагеназа с хлорамфениколом) - является комбинированным препаратом с протеолитическим и противомикробным действием наружного применения. Коллагеназа - протеолитический фермент, выделенный из Clostridium histolyticum, вызывает лизис некротизированных тканей, тем самым способствуя энзиматическому, безболезненному очищению раны. Кроме того, коллагеназа стимулирует процесс грануляции и не угнетает эпителизацию. Коллагеназа не оказывает протеолитического действия на неповрежденный эпителий, грануляционную, жировую и мышечные ткани. Хлорамфеникол является антибиотиком широкого спектра действия, активен в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий.

Биосептин - препарат в виде мази, в состав которого входят ферменты продуцируемые Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, обладающие выраженной антагонистической активностью по отношению к широкому спектру патогенных микроорганизмов и противовирусной активностью за счет способности одного из штаммов синтезировать альфа-2-интерферон.

Действие препарата состоит из двух этапов. На первом этапе вещества, обладающие антисептическими свойствами, уничтожают присутствующие на обработанной поверхности аэробные и анаэробные, грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы (стрептококки, стафилококки, сальмонеллы, различные виды шигелл, синегнойную палочку и т.д.), а также различные виды вирусов и грибков. Специфические протеазы разрезают поврежденные белки тканей и способствуют их удалению. Другие биологически активные вещества обеспечивают дополнительное питание имеющихся здоровых клеток, утилизацию поврежденных тканей, индукцию интерферона и стимуляцию преимущественно клеточного иммунитета. Препарат всасывается в ткани и образует защитную пленку на поверхности.

На втором этапе действия споры имеющихся в мази бактерий трансформируются в вегетативные формы и обеспечивают пролонгированное действие препарата, проявляя антагонизм относительно внешней патогенной микрофлоры, а также усиливая эффекты, полученные на первом этапе.

Испытания мази, проводившиеся на животных, показали, что она не обладает токсикогенными, аллергенными, тератогенными, мутагенными, эмбриотоксическими, местнораздражающими и кат генными свойствами.

Лизоамидаза - это бактериолитический фермент, продуцентом которого является грамотрицательная бактерия рода Xsantomonas.

Объектами действия лизоамидазы являются грамположительные бактерии, не имеющие внешней мембраны.

В состав лизоамидазы входят три бактериолитических фермента:

1) лизоцимоподобная N-ацетилмурамидаза (мурамидаза);

2) N-ацетилмурамиламидаза (амидаза);

3) пептидаза, с особенно большой скоростью расщепляющая
пептидную связь в глицил-глицине.

Кроме этих ферментов в составе лизоамидазного комплекса присутствуют протеиназа и фосфатаза, которые разрушают клеточные стенки патогенных бактерий. Наибольшей бактериолитической активностью обладает пептидаза, которая является главным бактериолитическим агентом лизоамидазного комплекса.

Лизоамидаза успешно используется не только в биологии (например, для получения лишенных клеточных стенок протопластов бактерий), но в медицине и ветеринарии. Оказалось, что препарат является эффективным средством борьбы со множеством устойчивых к антибиотикам патогенных микроорганизмов, таких как стафилококк, стрептококк и др. грамположительных бактерий.