Тема 18. Технология производства витаминов

Среди биологически активных веществ, необходимых для нормального развития организма животных, одно из первых мест занимают витамины. Важное значение витаминов объясняется их участием в биохимических реакциях, способностью служить катализаторами процессов, обеспечивающих обмен веществ в организме и его связь с окружающей средой.

Витамины - низкомолекулярные органические соединения, присутствующие в живых клетках в низких концентрациях и являющиеся компонентами энзиматических систем, ответственных за различные реакции.

Производство витаминов осуществляется следующими основными путями:

1. Экстракция витаминных препаратов из растительного или животного сырья. С этого направления начиналась витаминная промышленность, поскольку первые витаминные препараты были получены именно таким путем. Например, витамин В₁₂ получали из сырой печени крупного рогатого скота, каротин - из моркови. Но в настоящее время доля витаминов, получаемых этим методом, незначительна ввиду очень низкого содержания их в природном сырье и ограниченности сырьевых ресурсов.

2. Химический синтез витаминов. Производство синтетических витаминов занимает, пожалуй, ведущее место в современной витаминной промышленности, поскольку основная номенклатура витаминных препаратов представлена веществами, полученными химическим синтезом из химических видов сырья или сочетанием химического синтеза с биосинтезом. Однако такой способ производства витаминов представляет собой сложный, многоступенчатый процесс, сопряженный с большими производственными затратами, что делает конечные продукты слишком дорогими.

3 .Биосинтез витаминов. Некоторые витамины, имеющие сложное строение, химический синтез которых в крупномасштабном производстве невозможен или экономически нецелесообразен, получают исключительно биосинтезом, с применением микроорганизмов, способных к сверхсинтезу и накоплению определенных витаминов. Примером может служить производство цианкобаламина (витамина В₁₂). Микробиологический синтез применяется также в производстве витаминных концентратов, предназначенных для сельского хозяйства, поскольку в данном случае обычно в индивидуальном чистом виде витамины не выделяют.

Следует отметить условность такого деления витаминной промышленности. Производство некоторых витаминов включает и химические стадии и стадии биотрансформации с применением микроорганизмов (например, производство аскорбиновой кислоты). Витамин рибофлавин получают и синтетическим и микробиологическим путями. Некоторые витаминные препараты (например, витамин D₂) получают путем химической модификации провитаминов или витаминов, выделенных из растительных клеток или органов животных.

Использование витаминов в качестве добавок в корма животных требует крупномасштабного производства, поэтому возникла необходимость в более дешевых способах изготовления витаминов. Таким перспективным способом получения ряда витаминов оказался микробиологический синтез.

Для нормальной деятельности организма животных и птиц необходимо включать в рационы витамины A, D, К, группы В и др.

Микробиологическая промышленность нашей страны выпускает кормовые препараты витаминов В₂ и B₁₂. Кроме того, микробиологическим можно считать и производство витамина D₂, который образуется из эргостерина при облучении ультрафиолетовым светом кормовых дрожжей.

Микроорганизмы содержат много различных витаминов, которые чаще всего являются компонентами ферментов. Состав и количество витаминов в биомассе зависят от биологических свойств культуры микроорганизмов и условий их культивирования. Так, кормовые дрожжи, получаемые на гидролизатах древесины и углеводородах, сравнительно богаты витаминами группы В и содержат (в расчете сухую биомассу) следующие витамины (мг/кг):

Тиамин (В₁) - 15-18

Рибофлавин (В₂) - 45-68

Биотин - 1,6-3,0

Инозит - 400 -5000

Фолиевая кислота - 3,4-21,5

Никотиновая кислота - 440-610

Продукцию микроорганизмами отдельных витаминов можно увеличить, изменяя состав питательной среды. Например, количество витамина В₂ (рибофлавина) в биомассе дрожжей зависит от интенсивности аэрации и содержания железа в среде.

На содержание витаминов в клетках дрожжей заметное влияние оказывают микроэлементы. Так, небольшие добавки марганца способствуют накоплению в клетках дрожжей инозита, а повышенные дозы кобальта приводят к увеличению содержания витамина В₆ (пиридоксина).

Производство кормового концентрата витамина В₂ (рибофлавин). Витамин В₂ входит в структуру многих ферментов, в составе которых участвует в клеточном дыхании, синтезе белков и жиров, регулировании состояния нервной системы, функции печени и т.д. При его недостатке резко замедляется рост, нарушается белковый обмен.

Суточная потребность в витамине В₂ составляет для птиц 3 - 4 г (кристаллического препарата) на 2 т корма, а для свиней 10 - 15 мг на 100 кг живой массы.

В природных условиях источниками рибофлавина являются высшие растения, дрожжи, мицелиальные грибы и бактерии. Большинство микроорганизмов образуют свободный рибофлавин.

В 30-е годы XX в. был найден суперпродуцент витамина - микроскопический гриб Eremothecium ashbyii, образующий до 6000 мкг рибофлавина на 1 г сухого вещества культуральной жидкости.

Для получения витамина В₂ можно также использовать культуру дрожжей, ацетобутиловые бактерии, продуцент лизина Brevibakterium и др.

 

Микроорганизмы — продуценты рибофлавина

Микроорганизмы - продуценты	Выход витамина (мг%)
Clostridium acetobytylicum
Mycobakterium smegmatis
Mycocandida riboflavina
Candida flaveri
Eremothecium ashbyii	2480-6000
Ashbyii gossipii

 

Технология получения кормового препарата витамина В₂ микробиологическим способом достаточно проста. В качестве микроорганизма-продуцента обычно используют Е. ashbyii.

Технологический процесс производства состоит из трех основных стадий:

1. Аэробная ферментация.

2. Термолиз и концентрирование.

3. Сушка, размол, гранулирование и упаковка.

Посевной материал и стерильный воздух получают по типовой, для многих микробиологических производств, схеме. Ферментация осуществляется в типовых биореакторах объемом 63 - 100 м₃ в стерильных условиях при температуре 28 - 30 °С.

Основными ингредиентами питательной среды являются соевая мука, меласса, технический жир и минеральные соли (СаСОз, КН₂Р0₄). Продуцент витамина В₂ выращивают также на средах, где источником углерода является глюкоза, сахароза, крахмал, пшеничная мука. В качестве источника азота используют молочную сыворотку, рыбную и кукурузную муку или экстракт, казеин. Развитие гриба-продуцента стимулируется добавлением ненасыщенных жирных кислот, биотина, тиамина, инозита, ростовых веществ, содержащихся в зародыше пшеницы, картофельном соке и дрожжевом автолизате.

Известно использование в производственных условиях питательной среды следующего состава:

- 1 - 3 % мелассы, гидрола или глюкозы;

- 3 - 8 % кукурузного экстракта или дрожжевого автолизата;

- добавки N, Mg, Zn.

Культивирование продуцента проводят поверхностным или глубинным способом. Витамин накапливается в клетках гриба-продуцента, либо в виде предшественника - флавина дениннуклеотида, либо в свободном состоянии.

Время культивирования длится 60 - 80 ч до начала лизиса мицелия гриба и образования спор (определяется микроскопически). При этом содержание рибофлавина в культуральной жидкости достигает 1200 мг/л.

Для сохранения штамма Е. ashbyii в активном состоянии рекомендуется производить систематический его рассев на твердые питательные среды и отбирать колонии наиболее.интенсивно окрашенные в оранжевый цвет. Яркая окраска колонии коррелирует с высокой способностью к синтезу рибофлавина.

При подготовке инокулята гриб пересевают последовательно по схеме:

посев на скошенную агаризованную среду в пробирке > жидкая среда > колба > бутыль > инокулятор

Винокуляторе культуру выращивают в течение 21-26 ч. затем ее переводят а биореактор с питательной средой, содержащей кукурузную и соевую муку, кукурузный экстракт, свекловичный сахар, КН₂РО₄, СаСОз, NaCl и технический жир.

Среду стерилизуют в смесителе при 120 – 122 °С в течение 1 часа. Культивирование в биореакторе ведут до начала лизиса клеток и появления спор (определяют микроскопически). Температура культивирования 28 - 30 °С, давление воздуха в биореакторе (1 - 2) - 10⁴ Па, расход воздуха 1,5 -2,0 л в минуту на 1 л культуральной жидкости. Выход рибофлавина около 1200 мг/л.

По окончании процесса ферментации культуральную жидкость вместе с мицелием передают в вакуум-выпарные аппараты (10), где ее нагревают до 80 °С с целью разрушения (термолиза) клеточных структур и одновременно ведут процесс концентрирования (упаривания) до содержания сухих веществ 30-40 %.

Полученный после упаривания концентрат в виде сиропообразной биомассы высушивают в распылительной сушилке до содержания влаги не более 8 %. В результате получают смесь биомассы мицелия Е. Ashbyii и сухих остатков питательной среды. Для получения однородного товарного продукта смесь размалывают и просеивают. На современных предприятиях концентрат гранулируют, поскольку порошкообразный продукт сильно пылит, что создает неудобства работы с ним и приводит к его потерям.

Кормовой концентрат витамина В₂ представляет собой обработанную, высушенную, размолотую или гранулированную биомассу гриба-продуцента Е. ashbyii, содержащую не менее 15 мг рибофлавин на 1 г вещества. Помимо витамина В₂, концентрат содержит 0,3- 0,5 % других витаминов группы В (В₁, В₆, В₁₂, никотинамид), около 20% белковых веществ, а также полисахариды, липиды, минеральные соли.

Для животноводства можно получить кормовой рибофлавин как отход при производстве ацетона. Продуцентами витамина при этом являются ацетобутиловые бактерии.

Преимущество и рентабельность микробного синтеза витамина В₂ иллюстрируется следующими цифрами: из 1 т моркови получают 1г витамина, из 1 т тресковой печени - 6 г, а из 1 т культуральной жидкости гриба E.ashbyii - 25 кг.

Производство витамина В₁₂(цианкобаламина). Среди неполимерных биологически активных соединений витамин В₁₂ имеет самое сложное строение. Его принятое химическое название α-(5.6-диметилбензимидазолил)-кобамидцианид. Это единственный витамин, в структуру которого входит кобальт.

Организм животных не способен к самостоятельному синтезу витамина В₁₂. Этот витамин полностью отсутствует в растительных кормах в относительно небольших количествах содержится в кормах животного происхождения (рыбной и мясо-костной муке, молочных отходах). Среди растительного мира витамин В₁₂ был обнаружен лишь у нескольких видов высших растений (горох, фасоль, побеги бамбука), причем его происхождение в этих растениях окончательно не установлено.

Цианокобаламин обладает высокой биологической активностью с широким спектром действия. В первую очередь, витамин B₁₂ необходим для нормального кроветворения и созревания эритроцитов, он является эффективным противоанемическим препаратом. Цианкобаламин применяют для лечения злокачественного малокровия, железодефицитных анемий, апластических анемий и т.п. Этот препарат назначают также при лучевой болезни, заболеваниях печени, полиневритах, болезни Дауна, детском церебральном параличе и многих других заболеваниях.

Для медицинских целей субстанцию витамина B₁₂ получают в виде кристаллического тёмно-красного порошка, содержащего не менее 99% основного вещества. Из этой субстанции готовят различные лекарственные формы, из которых наиболее широкое применение находят цианкобаламин в изотоническом растворе хлорида натрия для инъекций, и таблетки, содержащие цианкобаламин и фолиевую кислоту.

Важное значение витамин B₁₂ имеет для животноводства. Его недостаток тормозит рост животных и приводит к серьезным заболеваниям. Цианкобаламин повышает усвояемость белка растительных кормов и является необходимым фактором полноценного питания животных.

Для животноводства отечественной промышленностью выпускается кормовой концентрат витамина В₁₂ (КМВ-12), который по эффективности не уступает кристаллическому препарату, но является более дешевым и доступным для широкого использования в сельском хозяйстве.

Полный химический синтез витамина В₁₂ был осуществлен через 25 лет после его открытия Р. Вудвордом и А. Эшенмозером с участием большой группы исследователей нескольких лабораторий университетов и научных центров США, Англии, Франции, Японии. Конечно, химический синтез витамина В₁₂ имеет чисто теоретическое значение и в настоящее время он не может рассматриваться как вариант промышленного производства этого важного препарата.

Единственным способом получения витамина В₁₂ в промышленном масштабе является его микробиологический синтез с использованием специальных штаммов микроорганизмов, способных активно продуцировать этот витамин.

В природе витамин В₁₂ синтезируют многие микроорганизмы (например, метанобразующие и пропионовокислые бактерии), а также бактерии,осуществляющие термофильное метановое сбраживание сточных вод.

Активно продуцируют витамин В₁₂ представители рода Pzopionibacterium, природные штаммы которых образуют 1,0 - 8,5 мг/л цианокобаломина, а полученный искусственный мутант P. shermanii M-82 способен накапливать витамин В₁₂ до 58 мг/л.

Практический интерес для микробиологического синтеза этого витамина имеют представители актиномицетов и родственных микроорганизмов. Истинный витамин B₁₂ в значительных количествах синтезируют Nocardia rugoza (до 18 мг/л), а также представители рода Miromonospora. Высокой кобаламинсинтезирующей активностью обладают метаногенные бактерии, например, Methanosarcina barkeri, M. vacuolita и отдельные штаммы галофильного вида Methanococcus halophilus (до 16 мг/л).

Цианкобаламин синтезируют строго анаэробные бактерии из рода клостридий. В значительных количествах образуют витамин B₁₂ ацетогенные клостридии C.thermoaceticum, C.formicoaceticum и Acetobacter woodi, синтезирующие ацетат из СО₂.

Известны активные продуценты витамина Bi₂ переди псевдомонад. Некоторые штаммы Pseudomonas denitrificans нашли применение для промышленного получения цианкобаламина (фирма Merk, США). Интерес представляют также термофильные бациллы, а именно Bacillus eirculans и Bacillus stearothermophilus, которые растут при температурах, соответственно, 60 °С и 75 °С и за 18-24 культивирования без соблюдения стерильных условий дают высокие выходы витамина.

В нашей стране в качестве основного продуцента витамина В₁₂, получаемого для медицинских целей, используют культуру Propionibacterium shermanii, а для нужд животноводства применяют смешанную культуру, содержащую термофильные метанобразующие бактерии.

На большинстве зарубежных предприятий витамин В₁₂выпускают в чистом кристаллическом виде и применяют в животноводстве большей частью в виде компонентов премиксов.

Указанный способ включения витамина В₁₂ в кормовые рационы применяется и в нашей стране.