Приготовление вирусных антигенов-диагностикумов

Приготовление вирусных диагностикумов имеет свои особенности. Диагностические антигены готовят, используя органы зараженных животных, то есть в таком случае речь идет об органных антигенах. Если такие антигены готовят с использованием культур клеток, то получают культуральные антигены. Основным их недостатком является содержание в своем составе балластных белков, в том числе белков других вирусов, которые могут быть в исходном сырье. Это влияет на специфичность и активность антигенов. Поэтому одной из сложных задач при производстве вирусных препаратов является их очистка.

Технология производства вирусных антигенов (герпеса простого и вируса болезни Ауески):

1. В роллерный матрац Винчестера с минимальной средой Игла (МСИ),
содержащей 10 % триптозофосфатного бульона и 10 % сыворотки теленка,
внести 2-Ю⁷ клеток ВНКС13 и выращивать при 37 °С в течение 3 сут.

2. Инфицировать культуру клеток суспензией производственного штамма вируса (20 мл в среде Игла, не содержащей сыворотки) при множественности заражения 1 БОЕ на 300 клеток.

3. Инкубировать при 37 °С в течение 1 ч для адсорбции вируса клетками. Добавить 50 мл среды Игла с 5 % триптозофосфата и 5 % сыворотки теленка и инкубировать при 37 °С в течение 2 дней (для вируса герпеса простого), в течение 27 - 36 ч (для вируса псевдобешенства).

4. Встряхивая сосуды, отделить клетки от стекла. Если клетки не отделяются, обработать монослой раствором версена.

5. Осадить клетки центрифугированием при 400 g в течение 10 мин.

6. Слить надосадочную фракцию и центрифугировать ее при 20000 g в течение 90 мин.

7. Полученную надосадочную фракцию слить в раствор хлорофоса, а осадок суспендировать в МСИ с 10 % триптозофосфата и 5 % сыворотки теленка (2 мл на бутыль).

8. Образовавшие осадок клетки разрушить в УЗД или тремя циклами замораживания и оттаивания в водяной бане.

9. Осадить обломки клеток при 400g в течение 10 мин.

10.Надосадочную жидкость, содержащую вирус, проверить на бактериальное загрязнение, инокулируя препараты в бульон с экстрактом сердца и мозга (1 неделя при 37 °С) или в жидкую среду Саборада (1 неделя при 37 °С).

11.Вирусы очищают седиментацией в растворах с высокой плотностью, например в насыщенных растворах КВг. В этих условиях выявляются полосы, соответствующие вирионам и пустым частицам.

12.Проводят контроль качества препарата согласно нормативной документации.

Тема 13.ТЕХНОЛОГИЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ

 

Технология приготовления бактериофагов, в основном, аналогична технологии приготовления вирусных препаратов, только вместо эукариотов используются бактериальные клетки, в которых бактериофаги размножаются.

Высокая специфичность некоторых штаммов бактериофагов позволяет использовать их для диагностики инфекционных заболеваний и индикации патогенных микроорганизмов. Фагоиндикация позволяет установить природу возбудителя инфекции даже в том случае, когда

В последние годы получение бактериофаги широко используется как экспериментальная модель в молекулярной биологии, генной инженерии, биохимии и биофизике.

Выявление фаговых частиц и определение их количества. Если к растущей в жидкой среде культуре чувствительных бактерий добавить в небольшом количестве частицы вирулентного бактериофага, то, бактериальные клетки окажутся зараженными. В течение некоторого времени никаких видимых изменений зараженных клеток обнаружить нельзя. Обычно этот период продолжается от 15 мин до 1 ч, а иногда и более (длительность его зависит от природы фага и бактерии, а также от условий культивирования). Затем внезапно происходит лизис зараженных клеток.

При лизисе клетки из нее высвобождается большое количество новых фаговых частиц. Эти частицы могут в свою очередь заражать другие клетки популяции, и при этом вновь повторяется тот же самый процесс. Следовательно, если в культуру внести даже небольшое (по сравнению с количеством бактериальных клеток) число инфекционных фаговых частиц, то через несколько часов практически вся популяция бактерий будет уничтожена

Число фаговых частиц или зараженных бактериальных клеток в суспензии легко определить, если подходящее разведение этой суспензии нанести на чашку с агаром, поверхность которого равномерно покрыта разбавленной суспензией чувствительных бактерий. После соответствующей инкубации вся поверхность чашки будет покрыта сплошным слоем бактерий, за исключением тех мест, где оказались частицы фага или зараженные клетки. В результате последовательных циклов развития фага пленка бактерий вокруг таких точек локально разрушается и образуются прозрачные зоны лизиса - бляшки.

Если имеется смесь зараженных клеток и свободных фаговых частиц, то с помощью соответствующих методов их можно разделить (используя, например, дифференциальное центрифугирование) и затем с помощью описанного метода подсчета бляшек определить по отдельности число тех и других.

Если нужно определить лишь число фаговых частиц, содержащихся в суспензии, то можно избирательно убить присутствующие в ней зараженные клетки. Обычно для этого суспензию клеток и фага встряхивают с хлороформом, к которому бактериофаги устойчивы.

Выделение и очистка бактериофагов. Метод подсчета числа бляшек может быть использован для выделения тех фагов, которые способны развиваться в определенных видах или штаммах бактерий. Для этого пробу материала из природного местообитания такой бактерии встряхивают с водой, освобождают эту суспензию от бактерий, пропуская ее через мембранный фильтр или обрабатывая хлороформом; аликвоты смешивают с суспензией данной бактерии и высевают на чашки с агаром.

Любая бляшка, которая выявляется на чашках, соответствует присутствовавшей в природном материале фаговой частице. Фаг из отдельной бляшки можно выделить, прикоснувшись к ней стерильной иглой и суспендировав прилипший к игле материал в небольшом объеме стерильного раствора. Обычно в такой суспензии оказывается от 10 до 10 фаговых частиц. Затем проводят очистку фага, последовательно повторяя такое выделение из отдельной бляшки.

Для получения больших количеств фага для химического или физического исследования заражают фагом экспоненциально растущую к жидкой среде культуру бактерий. В результате ряда циклов развития фага большинство, а иногда и все клетки культуры, лизируются. Затем оставшиеся в культуре клетки и их обломки удаляют с помощью низкоскоростного центрифугирования, а получившуюся жидкость стерилизуют либо фильтрованием, либо обрабатывая ее хлороформом. В результате получается стерильный лизат, который содержит обычно от 10 до 10 фаговых частиц на 1мл, а также растворимый материал и фракцию частиц, которые освобождаются из клеток при лизисе.

Для окончательной очистки бактериофагов обычно используют ультра центрифугирование. Даже самые мелкие фаговые частицы осаждаются при ускорениях порядка 100 000 g (в 10⁵ раз превышающих ускорение под действием земного притяжения). Часто предварительно вирусные частницы осаждают сульфатом аммония или некоторыми другими веществами.

Контроль фаговых препаратов проводят на чистоту, активность и специфичность.

Стерильность бактериофагов проверяют высевом на питательные среды и культивируют в термостатах при 37°С (для выявления бактериальной микрофлоры) и при 24 ° С (для выявления грибковой флоры). Препарат считают годным, если через 8 сут во всех средах не обнаруживают рост микроорганизмов. При выявлении роста бактерий или грибов хотя бы в одной пробирке проводят повторный контроль из удвоенного количества образцов. При повторном проросте сред препарат бракуют.

Активность и специфичность бактериофагов устанавливают на жидких и твердых питательных средах титрованием с соответствующим видом бактерий.

Если результаты проверки не соответствуют требованиям инструкций по изготовлению и контроль, то такой препарат не подлежит выпуску.