Тема 1. Приготовление посевного материала

И ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Стадия приготовления посевного материала

Штаммы микроорганизмов для производства биологических препаратов поступают на биопредприятие в виде чистых культур, законсервированными в ампулах. Каждая культура штамма имеет паспорт с описанием культурально-морфологических, биохимических и биологических свойств микроорганизма, характеристики сред и условий для их поддержания, выращивания, срока и условий хранения и транспортировки.

В основе хранения культур лежит охлаждение, замораживание или обезвоживание. Во всех этих случаях должен быть резко сокращен или полностью прекращен клеточный обмен веществ.

На практике культуры штаммов хранят с использованием следующих основных способов:

- на скошенном агаре при температуре -1 - -5 °С;

- замораживание со стабилизатором и хранение при температуре ниже -20 ° С. Недопустимо многократное оттаивание и замораживание;

- лиофилизация культуры и хранение в ампулах в течение нескольких лет.

Через определенное время, оптимальное для каждого способа хранения, культуру пересевают.

Перед началом технологических процессов культуру размножают в стерильных условиях.

Для приготовления посевного материала используют полноценную среду. Количество питательной среды в инокуляторе и биореакторе должно превышать 70% от общего объема. Если культуру в инокулятор вносят из колб, то количество посевного материала составляет примерно 0,1% объема питательной среды.

Для промышленных биореакторов обычно используют от 6 до 10% инокулянта. С плотной питательной среды выросшую культуру смывают стерильной питательной средой или физраствором и вносят в инокулятор в таком же объеме как и жидкую.

Тема 2. КЛАССИФИКАЦИЯ СПОСОБОВ И СИСТЕМ

КУЛЬТВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

 

Для осуществления любого биотехнологического процесса мик-робного синтеза необходимы культура микроорганизмов, питательная

 

 

среда, аппаратура для выращивания и проведения вспомогательных операций, средства контроля и управления.

Культивирование является основной стадией технологического процесса и во многом определяет количественные и качественные характеристики производства биопрепаратов.

На стадии культивирования осуществляется накопление, как самой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности) микроорганизмов.

Иногда (например, при производстве бактериальных препаратов) целевым продуктом является сама биомасса, в других случаях - продукты, синтезируемые клеткой (антибиотики, ферменты, аминокислоты и др.). При этом синтезируемый продукт может накапливаться как внутри клеток, так и выделяться в культуральную жидкость.

Необходимые полезные свойства целевых продуктов (клеток или продуктов метаболизма) создаются, в основном, на стадии культивирования. Основная задача на последующих стадиях состоит в том, чтобы при выделении, сушке и других операциях максимально сохранить и стабилизировать эти полезные свойства.

 

Классификация способов и систем культивирования

Микроорганизмов

 

Культивирование микроорганизмов осуществляется следующими основными способами: поверхностное, глубинное, периодическое, отъемно-доливное и непрерывное.

При твердофазном поверхностном культивировании клетки растут на поверхности твердой (плотной) среды, содержащей достаточное количество влаги и питательных веществ.

При жидкофазном поверхностном культивировании микроорганизмы растут на поверхности жидкой питательной среды, потребляя содержащиеся в ней субстраты и выделяя в эту среду продукты метаболизма.

При глубинном культивировании микроорганизмы распределяются по всему объему жидкой питательной среды, а источники газообразных продуктов питания (кислород, углекислый газ, азот) и компоненты питательной среды поступают к микроорганизмам в результате аэрации и перемешивания.

Глубинный способ культивирования микроорганизмов наиболее широко используется в производстве большинства биопрепаратов по следующим причинам:

1. Позволяет получить за более короткое время большее количество бактериальной массы или продуктов биосинтеза. Так, при культивировании микроорганизмов группы кишечной палочки в поверхностных условиях, количество микробов не превышает 1-2 млрд в мл применением глубинного культивирования, в зависимости от состава питательной среды и режимов культивирования, достигает 50-60 млрд. в мл.

2.Возможность осуществить управляемое культивирование, при котором основными управляющими воздействиями являются: аэрация, перемешивание, подача хладоагента или теплоносителя, титрантов для регулирования концентрации водородных ионов (рН), редуцентов для регулирования окислительно-восстановительного потенциала (еН) культуральной жидкости, пеногасителей для регулирования уровня пены в биореакторе, дозирования необходимых для оптимального роста культуры микроорганизмов азотных, углеводных, фосфорных и других субстратов, а также предшественников биосинтеза.

3.Возможность использования стандартного механизированного и автоматизированного технологического оборудования для культивирования (инокулятор, биореактор, что обеспечивает снижение подготовительных операций и операций съема биомассы) и повышения качества биопрепарата.

Для роста биомассы и биосинтеза продуктов метаболизма при культивировании необходимо соблюдение следующих условий:

- жизнеспособность посевного материала;

- наличие источника энергии;

- содержание в питательной среде компонентов, необходимых для синтеза биомассы;

- отсутствие в среде ингибиторов;

- поддержание в культуральной жидкости необходимых физико-химических условий жизнедеятельности культуры микроорганизмов.

 

Параметры роста

Основные факторы, влияющие на рост и развитие микроорганизмов, можно подразделить на две группы: внутриклеточные факторы, обусловленные структурой и специфическими особенностями организма, и внеклеточные факторы, т.е. условия внешней среды клетки. К внутриклеточным факторам относятся структура клетки, механизмы метаболизма и генетические характеристики, что является прерогативой цитологических, биологических и генетических исследований. Основной целью исследований в биотехнологии являются внеклеточные (внешние) факторы.

Для количественной характеристики роста микроорганизмов анализируются основные параметры роста.

Контроль роста. Под определением «биомасса» подразумевается общая концентрация микроорганизмов или клеток на твердой или жидкой питательной среде при культивировании. Выбор метода измерения зависит от задач исследований в области культивирования, биохимической характеристики культуры, питательной среды и требуемой точности измерений. Наименее чувствительным является метод определения веса сухой биомассы, а наиболее чувствительным – метод подсчета клеток.

 

Тема 3. ПЕРИОДИЧЕСКОЕ ГЛУБИННОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

 

Периодическое глубинное культивирование представляет собой закрытую систему, в которой скорость роста биомассы стремится к нулю из-за исчерпания субстрата и накопления ингибиторов. Такие системы всегда находятся в неустойчивом состоянии.

Фазы роста.

1. Лаг-фаза или индукционный период начинается после посева (инокуляции) в питательную среду микроорганизма и является периодом их адаптации. Во время этой фазы происходит реорганизация микро молекулярных и макромолекулярных составных частей микробной культуры, синтез или подавление ферментов или структурных компонентов клетки. Данная фаза, в зависимости от внешних условий, может быть короткой или довольно длинной. Во время этой фазы клеточная масса может изменяться без изменения числа клеток.

2. Лаг-фаза переходит в фазу экспоненциального роста. Это - период, быстрого накопления биомассы и продуктов реакции. Описывается экспоненциальной кривой.

3. Фаза линейного роста характеризуется сбалансированностью роста в установившемся состоянии, т.е. скорость роста остается постоянной на протяжении всего процесса культивирования, а химический состав культуральной жидкости изменяется, поскольку потребляются питательные вещества и вырабатываются продукты метаболизма. Как следствие этого, окружающая микроорганизмы среда непрерывно изменяется, но скорость роста в широком диапазоне концентраций питательных веществ не зависит от них.

4. Фаза линейного роста сменяется периодом, в течение которого скорость роста культуры снижается до нуля - это фаза замедления роста.

5. Далее рост культуры может переходить в достаточно устойчивую стационарную фазу, при этом скорость гибели микроорганизмов компенсируется скоростью прироста биомассы.

6. При полном истощении питательной среды (субстрата) и значительном накоплении ингибирующих рост продуктов происходят существенные физиологические изменения культуры (лизис) и наступает так называемая фаза отмирания культуры.

Закономерности размножения микроорганизмов при периодическом культивировании. Основные положения обратимого равновесного автокаталитического роста популяции микроорганизмом можно сформулировать следующим образом:

- размножение микроорганизмов определяется протеканием двух противоположных процессов - образования и гибели клеток, т.е. синтеза и деструкции;

- скорость образования микроорганизмов (синтеза биомассы) пропорциональна все увеличивающейся в процессе их культивирования концентрации X и уменьшается с уменьшением концентрации лимитирующего субстрата S;

- скорость отмирания клеток (деструкции биомассы) пропорциональна квадрату их концентрации;

- концентрация питательных веществ, необходимых для размножения микроорганизмов, определяется содержанием в питательной среде одного или нескольких лимитирующих компонентов;

- продукты лизиса погибших клеток (Sx) в кинетическом отношении (количественно, но не качественно) эквивалентны исходному субстрату;

- процесс размножения в условиях периодического способа культивирования заканчивается установлением равновесия, при котором скорости синтеза и деструкции биомассы равны, а поэтому концентрации микроорганизмов и субстрата не меняются во времени.

Компоненты питательной среды по характеру их превращения в процессе размножения и влиянию на кинетику роста популяции можно разделить на две группы:

- вещества, которые при включении в структуру клеток и последующем лизисе погибших клеток не претерпевают изменений, и не исключают возможность их повторного использования в метаболическом обмене при образовании новых микроорганизмов;

- вещества, которые в процессе синтеза биомассы претерпевают такие превращения, что их повторное использование микроорганизмами в качестве субстрата невозможно.

Таким образом, кинетическая эквивалентность исходного субстрата и продуктов лизиса погибших клеток в реальной системе клетка-среда может иметь место, если величина субстрата связана с концентрацией в питательной среде веществ, относящихся к первой группе, что и предполагалось при построении модели обратимого равновесного автокаталитического роста популяции.

Продуктивность периодических процессов культивирования. Объемная продуктивность выражается в граммах того или иного продукта на литр среды в час (или количества микробных тел) и служит мерой общей «полезности» процесса. При периодическом процессе культивирования расчет продуктивности должен вестись на все рабочее время, в которое необходимо включать не только время собственно культивирования, но и время, необходимое для того, чтобы освободить биореактор от предыдущей загрузки, промыть его, простерилизовать, заполнить новой партией среды и снова простерилизовать эту среду с биореактором. Необходимый для этого период времени может быть как коротким (например, 6 ч при производстве дрожжей), так и довольно длинным (например. 20 ч при производстве антибиотиков).