Тема 15. Технология приготовления диагностических сывороток

К диагностическим сывороткам, содержащим специфические антитела (иммуноглобулины) применяемым для обнаружения антигенов или для определения вида и типа микроорганизмов, относятся:

1. Агглютинирующие

2. Преципитирующие

3. Лизирующие (комплементсвязывающие)

4. Антитоксические

5. Флуоресцирующие.

Агглютинирующие сыворотки. Явление агглютинации впервые выявили Шарен и Роже в 1889 г. В 1896 г. Грубер и Дургам установили возможность использования реакции агглютинации (РА) для определения вида бактерий.

Наиболее широко агглютинирующие сыворотки применяют при дифференциации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae (эшерихиозы, сальмонеллезы и др.), рода Brucella, Listeria и др.

Агглютинирующие сыворотки готовят путём гипериммунизации животных корпускулярными антигенами. В качестве антигенов используют живые или убитые культуры микроорганизмов. В связи с непостоянным содержанием антигенных компонентов у одного и того же вида бактерий, желательно животных иммунизировать несколькими штаммами (2-3) этого вида микроба. Для получения поливалентных агглютинирующих сывороток прибегают к одновременному введению смеси антигенов из нескольких типов бактерий одного и того же вида.

Для получения агглютинирующих сывороток в качестве антигенов используют культуры бактерий в S-форме, а в качестве иммунизируемых животных - кроликов.

Иммунизацию в большинстве случаев проводят внутривенным способом в нарастающих дозах, с интервалом в 4 сут. Обычно делают 3-4 инъекции антигена.

Подкожный метод введения антигена применяют для первичного введения в случае повышенной его токсичности. Пробное взятие крови с целью установления титров агглютининов проводят через 6-7 сут после последнего введения антигена. Следовательно, весь цикл иммунизации длится около месяца.

Примером получения диагностических сывороток может служить приготовление агглютинирующих О-колисывороток.

Продуцентами являются кролики породы шиншилла весом 3-4 кг в возрасте 6-12 месяцев. Кроликов выдерживают в карантине не менее 3-4 недель. В качестве антигена используют суспензию 18 -20-часовых культур соответствующих серовариантов эшерихий, инактивированных кипячением 2 час. Антиген в концентрации 2 млрд в 1 мл вводится кроликам в краевую ушную вену с интервалом в 5 сут в дозах 0,3; 0,6; 1,0; 2,0; 3,0 мл. Через 5 - 6 сут после последнего введения антигена у каждого кролика определяют титры антител. От кроликов берут тотальным способом кровь и получают сыворотку. Сыворотку фильтруют через стерилизующие фильтры, проверяют на стерильность, активность и специфичность и лиофильно высушивают в ампулах.

Диагностические агглютинирующие сыворотки готовятся к лептоспирам, листериям, бруцеллам, кампилобактериям, эшерихиям, сальмонеллам и другим микроорганизмам, и используют в РА, РТГА, ГА, РБП, КР, ККРА и др. Технология их изготовления аналогична описанной, с учётом отдельных особенностей в каждом конкретном случае, что регламентируется соответствующими инструкциями.

Преципитирующие диагностические сыворотки в промышленных масштабах готовят для диагностики сибирской язвы. Первыми для этих целей получили преципитирующую сыворотку Асколи и Валенти в 1910 г. Они иммунизировали внутривенным способом лошадей слабовирулентной культурой возбудителя сибирской язвы.

В настоящее время в нашей стране преципитирующую сибиреязвенную сыворотку получают путём внутривенной иммунизации лошадей слобовирулентными штаммами возбудителя сибирской язвы 916-1, Ш-15,94 и штаммом второй вакцины Ценковского. Указанные штаммы выращивают на гороховом агаре с физиологическим раствором.

Лошадей гипериммунизируют поочерёдным введением каждого из указанных штаммов внутривенно. Всего делают 16-17 инъекций антигена, увеличивая дозу с 5 до 70 мл. В период гипериммунизации делают контрольные исследования сыворотки на накопление антител. По окончании гипериммунизации кровь от лошадей берут через 9-16 сут после последнего введения антигена из расчёта 800 мл на 50 кг массы животного. Из крови получают сыворотку методом цитрирования с последующим сепарированием и дефибринизацией плазмы. Сыворотку консервируют 0,5%-м раствором фенола, затем выдерживают в специальных отстойниках в течение 2 месяцев, после подвергают стерилизующей фильтрации, разливают во флаконы емкостью 50 - 100 смЗ, закрывают их резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками. После этого препарат подвергается биологическому контролю.

Преципитирующие сибиреязвенные сыворотки применяют для проверки кожевенного сырья на сибирскую язву (реакция Асколи), а также при исследовании патологического материала, особенно из загнивших трупов.

Преципитирующие диагностические сыворотки применяют, кроме того, для диагностики бруцеллёза, ящура, бешенства, лейкоза, инфекционной анемии и др. В этих случаях реакция преципитации ставится не в пробирках, а в агаровом геле, в специально выштампованных в нём луночках (реакция диффузной преципитации).

Технологический принцип приготовления таких преципитирующих сывороток такой же, как и преципитирующих сибиреязвенных сывороток. Но в качестве доноров чаще всего используют кроликов.

Диагностические сыворотки для постановки реакции связывания комплемента. При ряде инфекционных заболеваний образуются так называемые комплементсвязывающие антитела.

Чаще всего РСК применяют для диагностики бруцеллеза, ящура, сапа, кампилобактериоза, гриппа, ньюкаслской болезни и др.

Комплементсвязывающую сыворотку для диагностики ящура получают от морских свинок, которым вводят слабовирулентный вирус, адаптированный к организму новорождённых крольчат или к культурам клеток, с добавлением сапонина и спустя 30-40 сут дополнительно гипериммунизируют тем же материалом путём двух-четырех внутримышечных инъекций. Через 7-10 сут после последней инъекции морских свинок обескровливают и из крови готовят инактивированную сыворотку.

Сыворотку проверяют в РСК на активность и специфичность.

Следует иметь в виду, что при постановке РСК используют гемолитическую (индикаторную) систему, в которой в качестве специфической используется гемолитическая сыворотка (гемолизин).

Получается она на биопредприятии путём гипериммунизации кроликов эритроцитами баранов. Достижение титров гемолиза 1:6000 и выше даёт основания к прекращению гипериммунизации кроликов. Через 7-10 сут после последней инъекции кроликам эритроцитов барана их обескровливают, получают сыворотку и консервируют её фенолом.

При постановке РСК непременным условием является применение в качестве одного из её компонентов комплемента.

Комплемент - это неспецифический фактор гуморального иммунитета, содержащийся в сыворотках крови теплокровных и холоднокровных животных. Наиболее изучен комплемент морской свинки. Поэтому при постановке РСК в качестве комплемента используют кровь морских свинок.

Антитоксические диагностические сыворотки. Чаще всего антитоксические сыворотки готовят с целью диагностики клостридиоозов; злокачественного отёка, инфекционной энтеротоксемии, ботулизма и других заболеваний, возбудители которых образуют экзотоксины.

Технологическим примером является изготовление антитоксических сывороток С. perfringens типов А, С, D, Е и F.

Продуцентами таких диагностических сывороток чаще используют валухов тонкорунных пород в возрасте двух лет. Антигенами являются очищенные и концентрированные анатоксины, полученные с помощью соответствующих типов С.perfringens. Для каждого типа указанного микроорганизма используют продуцентов, которых содержат в отдельных боксах. Антигены овцам вводят подкожно в возрастающих дозах с интервалом 4-6 сут между инъекциями.

Гипериммунизацию животных прекращают после получения сывороток с активностью, предусмотренной инструкцией по её изготовлению. Поэтому в процессе эксплуатации у продуцентов берут кровь и в её сыворотке определяют титры антитоксинов. Активность каждого типа антитоксических сывороток устанавливают в реакции нейтрализации специфических токсинов при введении их смесей белым мышам или крысам и выражают её количеством антитоксических единиц.

В схеме гипериммунизации животных в каждом случае имеются свои особенности.

Флуоресцирующие диагностические сыворотки. Метод обнаружения антигена при помощи люминесцирующих антител был впервые предложен А. Кунсом в 1942 г. Это позволило увидеть под люминесцентным микроскопом комплекс антиген-антитело.

Сущность метода заключается в том, что по известному антигену, меченому флуорохромом, определяют неизвестный антиген. Некоторые флуоресцирующие красители (флуоресцеинизоцианата, флуоресце-инизотиоцианата - ФИТЦ, диметиламиннафталинсульфанил-хлорид и др.), не нарушая специфичности антител, обладают способностью вступать в химическую связь с ними. Такое меченое антитело соединяется со специфическим антигеном, образуя при этом конгломераты, светящиеся ярко-зелёным или зелено-жёлтым светом при люминесцентной микроскопии.

Кроликов иммунизируют многократно инактивированными антигенами и получают сыворотку крови с титром антител не ниже 1:6400-1:12800. Из сыворотки осаждают глобулины сульфатом аммония.

Для очистки глобулинов от сульфата аммония проводят диализ против физиологического раствора. Очищенный глобулин метят флуорохромом и консервируют мертиолятом, разливают в ампулы, лиофилизируют и проводят контроль на активность (красящий титр) и на специфичность.

Получение гипериммунных сывороток биотехнологическими методами позволяет сохранить здоровье и жизнь людей и животных, производить качественные и безвредные продукты питания благодаря лечебным свойствам сывороток, выпускать диагностические и лекарственные препараты.

На нынешнем этапе развития науки в промышленные производственные процессы прочно вошли современные технологии, позволяющие более эффективно осуществлять контроль технологических процессов на всех стадиях производства. Нет сомнений, что и в дальнейшем производственные методики будут совершенствоваться.