Получение культур клеток и их классификация

Следует иметь в виду, что при выращивании культур клеток необходимо исключить их контаминацию бактериями, грибами и вирусами. Для этого при работе с ними нужно соблюдать строжайшую стерильность, а от вирусной контаминации избавляются путем использования SPF доноров.

Культуры клеток из тех или иных тканей или органов получить несложно. Но эта технология требует скрупулезности, осторожности, определенных приемов и навыков. Клетки из тканей высвобождают путем размельчения и воздействием трипсина, папаина, коллагеназы, эластазы, муказы и т.д. Но наиболее пригоден для получения культур клеток очищенный трипсин. В размельченную ткань помещают очень слабо концентрированный (0,25 %) трипсин, который разрушает межклеточное вещество, что способствует разделению клеток. Применяя электромагнитную мешалку, центрифугу и многократно промывая клеточную суспензию, получают маточную основу живых клеток, которую помещают в соответствующую питательную среду. Затем выращивают культуру клеток в термостате при температуре 37°С и через 3-4 сут получают готовую культуру клеток. Наличие роста клеточной культуры определяют под микроскопом. Нормально растущая культура клеток под микроскопом будет представлять один слой клеток, вплотную прилегающих одна к другой, и имеющих типичную для данной культуры морфологию. При изменении температуры, рН среды рост клеток замедляется культура клеток может погибнуть.

Для получения культуры клеток применяются так называемые ростовые среды, содержащие белок сыворотки крови определенных животных, гидролизаты лактоальбумина и т.д.

Время генерации различных культур клеток составляет 15-50 ч. По достижении определенного, хорошего роста, дальнейшее их размножение прекращают. Такая культура клеток может использоваться для выращивания в ней вирусов (рис. 2).

Ткань плода или взрослой особи

 

Нормальная ткань

	Неопластическая ткань

 

 

Первичная культура

 

 

Первичная субкультура

 

Нормальная диплоидная

	Гетероплоидная клеточная

Трансформация

 

 

Строение и гибель

 

Постоянные (перевиваемые) линии

 

Рис. 2. Получение клеточных линий при культивировании in vitro

соматических клеток (по Гриффитсу Дж. Б., 1989)

 

Приведем конкретный пример получения клеточной культуры из почек телят (ПТ), применяемой выращивания вакцинного авирулентного штамма ТК-А (ВИЭВ) вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота. Для получения культуры клеток ПТ используют почки от теленка в возрасте 1-1,5 месяца. С почек снимают капсулу, измельчают почечную ткань до кусочков величиной 3-5 мм, тщательно промывают раствором Хенкса с антибиотиками. Измельченную ткань переносят в стерильную колбу и заливают ее 0,25% раствором трипсина в соотношении 1:10 -1:15. Дезагрегацию ткани проводят дробно с применением магнитной мешалки при температуре 35-37 С до полного истощения ткани. Для этого проводят 7-8 циклов по 10-15 мин каждый. Выход клеток из одного грамма почечной ткани составляют 40-50 млн.

Для выращивания клеток ПТ используют ростовую среду из гидролизата лактоальбумина с добавлением 10% нормальной сыворотки крови крупного рогатого скота. В данную среду вносят посевную дозу ПТ в концентрации 600-800 тыс. клеток/мл. Культивирование клеток ПТ осуществляется в матрасах при температуре 37 °С. Монослой клеток формируется на 5-е сутки. Смену ростовой среды проводят на 2 -3-й сутки. Контроль качества культуры осуществляют макро- и микроскопически.

После формирования монослоя культуру клеток отмывают раствором Хенкса дважды, удаляя тем самым сывороточный белок, препятствующий репродукции вируса после внесения его в культуру клеток.

В настоящее время все культуры клеток, используемые для выращивания и накопления вирусов можно разделить на следующие основные группы:

- первичная культура - такая культура клеток, для которой использованы клетки, органы или ткани, взятые непосредственно из организма;

- субкультура - клетки «первичной культуры», подвергнутые субкультивированию;

- клеточная линия - культура клеток, полученная из субкультуры;

- диплоидная клеточная линия - линия клеток, 75 % которых имеют кариотип, свойственный нормальной клетке организма, из которого они выделены;

- перевиваемая (стабильная) клеточная линия - бессмертная культура диплоидных клеток, которая в результате трансформации приобрела способность к неограниченному количеству пассажей (не менее 70 раз с 3-дневным интервалом);

- гетероплоидная клеточная линия - линия клеток, которая содержит менее 75%) диплоидных клеток. Такие клетки не обладают признаками новообразований. В то же время они не имеют ограничений способности роста in vitro.

По частоте использования клеточных культур они подразделяются на первичные (периодические) и перевиваемые (постоянные). Первые используются, как правило, однократно, то есть в технологическом процессе они используются разово. Вторые являются непрерывными, постоянными клеточными линиями, которые в технологическом процессе используются многократно.

Все постоянные клеточные линии, в отличие от культур нормальных первичных клеток с ограниченным сроком жизни, являются трансформированными. Другими словами, они изменены по ряду признаков, главным из которых является «бессмертие» (Сергеев В.А., 1993). Другие категории трансформации (например, онкогенность, контактное торможение, приспособление к среде и т.д.) у различных линий проявляется неодинаково. Все они получены при спонтанной или индуцированной трансформации клеток в организме или в культуре. Многие постоянные клеточные линии получены из опухоли животных.

Субкультивирование клеток, а затем и становление постоянной клеточной линии были успешными, когда первичную однослойную культуру получали путем посева механически измельченной суспензии трипсинизированных клеток.