Этапы работы по созданию лекарственных средств на основе культур растительных клеток и тканей

Форма проведения лекции: лекция с разбором конкретных ситуаций

План лекции

1. Этапы работы по созданию клеточных технологий для получения вторичных веществ.

2. Лекарственные препараты, получаемые из культур клеток растений.

 

1. Этапы работы по созданию клеточных технологий для получения вторичных веществ

1. Экономически обоснованный выбор объекта. Растения, выбранные для введения в культуру, должны содержать значительное количество ценных, экономически важных вторичных соединений. Особенно это относится к редким и исчезающим видам растений.

2. Первичное введение тканей в культуру. Для этих целей отбираются отдельные растения, обладающие наибольшим содержанием искомого вещества. Обычно вначале получают каллусы на твердой среде.

3. Химическое изучение биомассыпо количественному и качественному составу вторичных метаболитов. Пролиферирующие каллусные клетки растений за редким исключением содержат вторичных соединений меньше, чем органы целого растения. Это говорит о том, что в интактном растении синтез вторичных веществ находится под контролем цитодифференцировки. Подавление дифференциации клеток в культуре ведет к снижению их биосинтетического потенциала в отношении вторичных соединений. Неполная реализация генетических возможностей клетки может быть связана и с другими причинами, например с нарушениями автотрофности питания при переходе к гетеротрофному типу питания. Кроме того, под воздействием различных факторов может изменяться качественный состав продуктов. У некоторых растений переход к биосинтезу веществ вторичного метаболизма наступает при замедлении роста, для них применяют двухступенчатые режимы культивирования: вначале создают условия для интенсивного роста клеточной массы, а затем – для биосинтеза веществ. Для эффективного химического контроля за биомассой нужны экспресс-методы оценки веществ.

Следует подчеркнуть, что определение очень низких концентраций метаболитов в медленно растущих клетках представляет большую трудность. Поэтому в качестве экспресс-методов оценки каллусных культур в последнее время применяют радиоиммунохимический и иммуноферментный метод. Последний имеет преимущества благодаря более высокой скорости проведения анализов и возможности их автоматизации.

4.Оптимизация сред и параметров выращивания. Для реализации генетической информации, относящейся ко вторичному обмену, требуются специфические условия. Поскольку нет твердой уверенности в том, что используемые питательные среды полностью отвечают потребностям клеток, в каждом конкретном случае приходится подбирать среду и другие факторы, опираясь на опыт других исследователей. Эта работа еще более усложняется при переводе культуры в жидкую среду, так как при этом следует учитывать влияние факторов аэрации и перемешивания.

5. Создание продуктивных штаммов клеток. Получение гомогенной популяции клеток с высоким содержанием тех или иных вторичных веществ- сложная задача, так как популяции длительно культивируемых клеток, даже полученные клонированием одной высокопродуктивной клетки, могут терять способность к синтезу ценного соединения. Для поддержания на высоком уровне способности клеток к видоспецифическим биосинтезам, помимо оптимизации условий выращивания, требуются значительные усилия, включая генетические манипуляции с ними и клеточную селекцию. Для организации рентабельного крупномасштабного производства на основе клеточной технологии нужны мутанты, прототрофные по гормонам, нетребовательные к питательным средам, а также устойчивые к осмотическому и механическому стрессу. Получение мутантов и вариантов в культуре клеток приобретает все большее распространение. Так, обработка каллусных клеток раувольфии змеиной этиленамином позволила получить клеточную линию, отличающуюся высоким содержанием антиаритмического алкалоида аймалина. Дальнейшая оптимизация условий выращивания этой линии привела к увеличению продуктивности культуры по аймалину в 10 раз по сравнению с целым растением. Более эффективным приемом создания продуктивных штаммов является искусственное конструирование клеток методами клеточной и генной инженерии, которым принадлежит будущее.

6. Первичное использование лучших штаммов в суспензионной культуре.Каллусные клетки, первоначально полученные на твердой среде, переводят в жидкую среду.

Изменение режима культивирования не должно приводить к потере штаммом своих положительных качеств, т.е. штамм должен быть устойчив к стрессовым условиям культивирования. Особенно это касается момента переноса клеток из условий лабораторного эксперимента в небольших колбах в ферментеры крупных размеров.

Сейчас в биотехнологических производствах центральная роль принадлежит ферментерам с автоматической регуляцией различных факторов (температуры, газового состава, освещенности, кислотности, содержания физиологически активных веществ) на любом этапе развития культуры.

7.Выращивание продуктивного и устойчивого штамма в условиях, приближающихся к производственным, в ферментерах с последовательным увеличением их емкости. Если в этих полупромышленных условиях культивируемые клетки сохраняют высокие скорости роста и биосинтеза искомого вещества, накапливают его без деградации и в значительных количествах выделяют в среду, то такой штамм пригоден для организации крупнопромышленного производства. Кроме того, важным качеством штамма является его генетическая стабильность.

8. Составление технического регламента на производство биомассы и ее оценка. Производственная технология требует соответствующей аппаратуры, который располагает, в частности, Япония. Так, в 20000-литровом ферментере в непрерывной культуре в течение трех месяцев выращивались клетки табака, продуцировавшие убихинон с продуктивностью по биомассе 5,582 г/л в день. Там также налажено крупномасштабное производство и других вторичных метаболитов.

В н.в. в разных странах около ста видов растений используется в биосинтетической промышленности для получения экономически важных веществ, среди них – женьшень, раувольфия змеиная, наперстянка шерстистая пурпурная, диоскорея дельтовидная, воробейник, белладонна, паслен дольчатый, дурман обыкновенный, ландыш майский, клещевина, агава, амми зубная, мак снотворный и др.

2. В настоящее время в разных странах около ста видов растений исполь­зуются в биосинтетической промышленности для получения экономически важных веществ, среди них - женьшень, раувольфия змеиная, наперстянка шерстистая и пурпурная, диоскорея дельтовидная, воробейник, белладонна, паслен дольчатый, дурман обыкновенный, ландыш майский, клещевина, агава, амми зубная, мак снотворный и др.

М. Ценком с коллегами были собраны 184 образца семян из различных мест произрастания. Далее из проростков этих семян отобраны наиболее богатые алкалоидами серпентином и аймалицином (со­державшие их более 0,7% на сухую массу). Из проростков на агаризованной среде был получен первичный, каллус. Затем для выделения отдельных клеток каллус был переведен в суспензию. Далее для получения клеточных клонов суспензия высевалась на агар в чашки Петри, и каждая колония, выросшая из единичных клеток, пересаживалась в отдельную кол­бу с жидкой средой, обеспечивавшей хороший рост клеток. Когда клетки набирали определенную биомассу, ежи пересаживались на «продукционную» среду, где клетки при незначительном делении синтезировали искомые алкалоиды.

 

Таблица 7. Промышленное производство вторичных метаболитов на основе культуры тканей растений в Японии

 

Продукт	Растения	Применение
шиконин   убихион-10 аймалицин камптотецин берберин   антоциан	воробейник аптечный   табак барвинок розовый камптотека остроконечная коптис японский   цветочный сбор, виноград	ожоги, порезы, кожные заболевания болезни сердца гипотензивное средство противоопухолевое средство бактерициды, средство от расстройства кишечника пигмент

Контрольные вопросы

1. Какова специфика растительных клеток, определяющих условия их культивирования при получении лекарственных средств?

2. Какова роль биотрансформации при получении лекарственных средств на основе культур растительных клеток?

3. Каковы перспективы развития биотехнологии в получении лекарственных средств на основе культур растительных клеток? Могут ли трансгенные растения использоваться для получения лекарственных средств?

 

Лекция 28