Производство препаратов нормофлоры

Форма проведения лекции: информационная

План лекции

1. Производство препаратов нормофлоры

2. Общая схема технологического процесса производства пробиотиков

 

1. Необходимым условием массового производства препаратов эубиотиков является сохранение их стабильности в течение длительного времени. Бактерийные препараты, содержащие живые микроорганизмы, относятся к наименее стойким, их активность снижается за счет гибели клеток. Микроорганизмы, имея низкий уровень биологической организации, сохраняют жизнеспособность практически при полной потере воды, при этом в них обратимо замедляются или прекращаются обменные процессы. Для увеличения сроков жизнеспособности бактерий показана сублимационная сушка, проходящая в условиях низкой температуры и глубокого вакуума (незначительной концентрации кислорода).

По причине гигроскопичности укупорку сухих биопрепаратов проводят под вакуумом или в токе инертного газа.

К факторам, оказывающим влияние на выживаемость микроорганизмов в препаратах сухих эубиотиков при хранении, следует отнести:

- регламентированное содержание остаточной влаги;

- наличие защитных сред;

- хранение сухих препаратов в атмосфере, не содержащей кислород.

В целях защиты эубиотиков от кислой среды желудка на таблетированные и капсулированные формы наносят ацидорезистентные покрытия или проводят иммобилизацию бактерий на сорбенте.

Производство должно быть организовано в соответствии с ГОСТ Р 52249-2004 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств» (Good manufacturing practice for medicinal products (GMP))».

 

2. Общая схема технологического процесса производства пробиотиков

1. Подготовка производственных помещений, оборудования, посуды, персонала, вентиляционной системы – проводят в соответствии с требованиями инструкций, регламентирующих условия работы со стерильными лекарственными средствами.

2. Подготовка и стерилизация сред (концентрированной, производственной и защитной среды высушивания). Предварительные работы включают:

- качественный подбор необходимых для данной культуры веществ;

- оценку влияния отдельных компонентов на выход целевого продукта;

- нахождение оптимального соотношения составляющих и удешевление сред.

3. Выращивание маточных (до 6 пассажей) и производственных культур. Вначале выращивают маточную культуру из специального штамма при температуре 370 ^оС, используя различные питательные среды. Производственную культуру выращивают методом глубинного культивирования в реакторах, установленных в боксах. Реакторы оснащены магнитной мешалкой и паровой рубашкой.

4. Розлив жидкого полуфабриката во флаконы. Розлив микробной суспензии в ампулы и флаконы проводят на аппаратах розлива и запайки ампул. Заполненные ампулы и флаконы поступают на сублимацию.

5. Сублимационная сушка. Ампулы помещают в морозильные камеры под углом 750 ^о. Содержимое ампул замораживают при температуре -400 ^оС, выдерживают при этой температуре 18-24 ч, подвергая сублимации.

6. Укупорка. Ампулы с сухой микробной массой запаивают (флаконы укупоривают) с газовой защитой.

7. Маркировка, упаковка. Ампулы маркируют и упаковывают в пачки по 10 штук.

8. Контроль качества готовой лекарственной формы.

 

Контрольные вопросы

1. В чем заключается контроль качесвта готовой продукции?

2. Что такое государственная фармакопея?

3. Сублимация, лиофилизация, сущность процессов.

 

Лекция 23

Форма проведения лекции: информационная

Частная технология препаратов нормофлоры

План лекции

1. Частная технология препаратов нормофлоры

2. Номенклатура препаратов нормофлоры

 

1. Лактобактерин. Для производства лактобактерина применяют штамм лактобактерий Lactobacillus plantarum, который относится к роду Lactobacillococcus. Лактобактерии представляют собой грамположительные палочки длиной 0,7-3,0 мкм. Растут в атмосфере CO₂. N₂, O₂.

Лактобактерин сухой (Lactobacterium siccuum) получают по общей схеме для бактерийных препаратов.

1. Приготовление и стерилизация питательных сред:

1.1 Приготовление гидролизованного молока (к прокипяченному обезжиренному молоку с рН 7,7± 0,1 добавляют панкреатин и хлороформ, выдерживают при 40±2 ^оС 72 ч, затем фильтруют, разводят вдвое водой для инъекций, разливают в бутылки и стерилизуют).

1.2 Приготовление дрожжевого автолизата (хлебопекарные дрожжи разводят в бутылях водой для инъекций и стерилизуют).

1.3 Приготовление среды МРС (к гидролизованному молоку добавляют дрожжевой автолизат и навески следующих веществ: марганца и магния сернокислого, аммония лимоннокислого, глюкозы, др.).

1.4 Приготовление гидролизата казеина (в реакторе готовят раствор казеина, устанавливают необходимое значение рН, добавляют хлороформ, выдерживают пять суток при 45 ^оС, затем фильтруют в бутыли и стерилизуют).

1.5 Приготовление казеиново-дрожжевой среды.

1.6 Приготовление защитных сред высушивания (желатин, сахароза, молоко, натрий лимоннокислый и вода).

2. Получение маточной культуры

(6 пассажей в пробирках, чашках Петри, флаконах и бутылях – в течение 9 суток).

3. Выращивание производственной культуры

(в реакторах с жидкой питательной средой в течение 8-12 ч при 370 ^о; в 1 мл микробной суспензии производственного штамма должно быть не менее 6 млрд живых микробных клеток; к полученной микробной суспензии добавляют защитные среды высушивания – сахарозно-желатозную или обрат молока).

1. Розлив лактобактерина в ампулы

(доза зависит от концентрации живых микробных клеток).

2. Лиофильная (сублимационная) сушка:

1.1 Замораживание ампул с лактобактерином, расположенных наклонно под углом 75 ^о, в течение 18-24 ч в холодильной камере до минус 40 ^оС;

1.2 Лиофилизация (сублимирование) –сушка в условиях глубокого вакуума, длительность сублимации – 68-70 ч.

2. Запайка ампул

(в режиме газовой защиты – в атмосфере азота).

7. Контроль качества:

7.1 Описание: кристальная или пористая масса желтовато-белого цвета, кис-ломолочного запаха и вкуса. Определяют органолептически.

7.2 Подлинность определяется наличием характерных морфологических, культуральных и биохимических свойств в производственных штаммах лактобацилл.

7.3 Показатель рН растворенного препарата должен составлять 5,5±0,5.

7.4 Остаточная влажность лактобактерина в ампулах или флаконах не должна превышать 3,5 %, в таблетках – 5%.

7.5 Растворимость. Сухой препарат должен растворяться в воде, очищенной и добавленной из расчета 1 мл на 1 дозу, в течение 5 минут образовывать гомогенную взвесь, желтовато-бежевого цвета. Определяют визуально.

7.6 Бактериальная контаминация проверяется бактериоскопически и бактериологически.

Бактериоскопически – путем просмотра мазков, приготовленных из взвеси растворенного препарата и окрашенных по Грамму. В мазках должны быть клетки, характерные для лактобацилл (грамположительные).

Бактериологически – путем посева на питательные среды и инкубации в течение 2-х суток не должно содержаться колоний. Если обнаружили рост хотя бы в одной пробирке или чашке, производят повторный посев удвоенного количества образцов.

В случаях повторного роста серию препарата бракуют. Препарат сухой не должен быть контаминирован посторонней микрофлорой. Препарат в таблетках не должен содержать патогенных и условно-патогенных микроорганизмов; допускается наличие микробов сапрофитов в количестве не более 300 на 1 таблетку.

7.7 Специфическая безвредность. Препарат должен быть безвредным для белых мышей при введении его внутрь в количестве одной дозы. Наблюдение за мышами осуществляется в течение 5 суток. В случае гибели за этот срок хотя бы одной мыши контроль повторяют на удвоенном количестве животных. Если мыши не погибнут, препарат считают выдержавшим испытание; в противном случае данную серию препарата бракуют.

7.8 Специфическая активность. По количеству жизнеспособных клеток лактобацилл в 1 дозе препарата и активностью кислотообразования.

7.8.1 Определение количества живых лактобацилл в 1 дозе. Для определения количества живых лактобацилл в одной дозе препарата от каждой серии испытывают не менее 3-х образцов. Содержимое флакона после разведений высевают по 0,1 мл микробной суспензии на 4 чашки Петри. После 44 ч инкубации при t= 37 ^оС производят подсчет выросших колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе препарата.

7.8.2 Определение активности кислотообразования проводят титриметрическим методом при выращивании бифидобактерий в модифицированной печеночной среде. Каждую пробу титруют раствором натрия гидроксида 0,1 моль/л в присутствии индикатора фенолфталеина до появления слабо-розового окрашивания. В одной дозе препарата (1 таблетка) при выпуске должно содержаться не менее 2^.10⁹ живых лактобацилл. Показатель активности кислотообразования лактобактерина, выраженный в градусах Тернера (ТО), должен быть не менее 200.

7.9 Определение компонентов стабилизирующей среды высушивания и других веществ, входящих в состав препарата.

8. Маркировка и упаковка

При производстве таблеток лактобактерина микробную суспензию сушат в кассетах. Сухую микробную массу (СММ) протирают через металлическое сито в бутыли с азотом. Таблеточную массу готовят в шаровой мельнице с добавлением к СММ вспомогательных веществ (лактозы, аэросила, кальция стеарата). В таблеточной массе определяют количество живых лактобактерий и рассчитывают массу таблетки. Таблетирование ведут методом прямого прессования в асептических условиях при строгом соблюдении влажности воздуха (не более 50 % при 18 ^оС). Таблетки передают на фасовку во флаконы. Препарат должен находиться в вакууме, атмосфере азота или стерильного воздуха. С целью защиты бактерийных препаратов от агрессивной кислой среды желудка создаются таблетки с ацидорезистентным покрытием, капсулированные формы, иммобилизованные на сорбенте бактерии. Предприняты попытки создания микрокапсулированных форм пробиотиков.

Продолжительность процесса производства лактобактерина в ампулах и таблетках составляет соответственно 42 и 66 суток.

Хранят препарат в сухом, темном месте при Т= 5±3 ^оС.

Срок годности 12 и 6 месяцев. Срок годности равен 12 месяцам, если в одной дозе при выпуске содержится 4 млрд и более живых лактобацилл; 6- при содержании от 2 до 3,9 млрд. К концу срока годности должно содержаться 1 млрд живых лактобацилл.

2. Последние годы характеризуются бурным увеличением количества пробиотиков за счет как модернизации и улучшения свойств старых препаратов, так и появления новых, в том числе поликомпонентных, содержащих новые штаммы микроорганизмов, а также различные биологически активные вещества. Это позволило классифицировать группу пробиотиков на несколько составляющих ее подгрупп:

1. Монокомпонентные. Бифидосодержащие (бифидумбактерин, состоящий из штаммов вида B. breve, бифидин, содержащий штаммы вида В. аdolescentis M-42). Лактосодержащие (биобактон, состоящий из ацидофильных лактобактерий). Препараты из апатогенных представителей рода bacillus (споробактерин).

2. Поликомпонентные. Бифилонг, ацилак, аципол, биоспорин, линекс – 3-х компонентный препарат из ацидофильных лактобактерий, бифидобактерий инфантис и фекального стрептококка. Бифилак, бификол, бифиформ, бифилонг, ацепол, ацелак, линекс.

3. Комбинированные. Бифидумбактерин форте, кипацид – лактобактерии и комплексный иммуноглобулин, препарат с лизоцимом – бифилиз, биофлор жидкий с экстрактом сои, овощей и прополиса.

4. Иммобилизованные на сорбенте бактерии – бифидумбактерин форте.

Бифидо- и лактосодержащие пищевые продукты – бифилакт, бифидок и др.

Бактисубтил (Bactisubtile) – препарат на основе устойчивых к действию желудочного сока спор бактерий, прорастание которых происходит в кишечнике. Вегетативные формы бактерий высвобождают энзимы, расщепляющие углеводы, жиры, белки; в результате образуется кислая среда, угнетающая процессы гниения. Препарат препятствует нарушению синтеза в кишечнике витаминов группы В и Р. Форма выпуска – капсулы.

Бифидумбактерин в порошке (Bifidum bacterium in pulveris) представляет собой лиофилизированную микробную массу живых антагонистически активных штаммов Bifidumbacterium bifidum. Обладает антибактериальной активностью в отношении широкого спектра патогенных и условнопатогенных бактерий, восстанавливает микрофлору кишечника, нормализует деятельность ЖКТ, обладает иммунорегулирующими свойствами. Назначают при дисбактериозе у детей и взрослых. Выпускается в виде таблеток, во флаконах, пакетах и ампулах.

Бификол сухой (Bificolum siccum) представляет собой микробную массу живых антагонистически активных штаммов Bifidobacterium bifidum и E.coli. Применяется для лечения больных хроническими колитами разной этиологии на фоне дисбактериоза у детей и взрослых. Форма выпуска – флаконы и таблетки.

Бифилиз (Bifilys) в 1 мл содержит 5 млн живых бифидобактерий, органические кислоты, легкоусвояемый белок, лизоцим. Показан при острых кишечных заболеваниях вируснобактериальной природы.

Бифилонг сухой (Bifilong siccum) представляет собой микробную массу живых антагонистически активных двух штаммов Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum. В виде лиофилизата выпускается в ампулах и флаконах. Применяется для лечения острых и хронических заболеваний кишечника, профилактики и лечения дисбактериоза у детей и взрослых.

Биовестин – экологическичистая эмульсия живых бифидумбактерий (активнее сухого бифидумбактерина). Назначают при диатезах и иммунодефицитах с первых дней жизни.

Лактобактерин в порошке (Lactobacterinum in pulvis)- сухая микробная масса живых антагонистически активных двух штаммов Lactobacterium acidophilus. Форма выпуска – ампулы.

Аципол сухой содержит штаммы Lactobacterium acidophilusи полисахарида кефирных грибков. Рекомендован детям с первых дней жизни и взрослым для коррекции дисбиотических изменений в кишечнике.

Линекс (Linex) содержит Lactobacterium acidophilus, Bifidobacterium bifidum, E. faecalis. Поддерживает физиологическое равновесие кишечной микрофлоры.

Колибактерин сухой – лиофилизированнаямикробная масса живых бактерий E. coli. Применяется для лечения детей и взрослых, страдающих хроническим колитом. Форма выпуска – флаконы, ампулы и таблетки.

Споробактерин сухой – микробная масса живых бактерий Bacillus subtilis. Применяется для лечения хирургических инфекций мягких тканей, остеомиелита, дисбактериозов. Выпускается в виде лиофилизированной массы в ампулах.

Энтерол 250 (Enterol -250) применяется в качестве активного компонента, содержит лиофилизированные дрожжи Sacchoromyces boulardii, механизм действия которых принципиально отличается от механизма действия других бактериальных препаратов. Sacchoromyces boulardii обладают генетически обусловленной устойчивостью к антибиотикам и поэтому при проведении антибактериальной терапии сохраняют свою активность. Они не колонизируют пищеварительный тракт, клетки дрожжей элиминируются с калом в течение нескольких дней после завершения курса терапии. Таким образом, Sacchoromyces boulardii действуют как «временная» кишечная микрофлора, способная сохранять или восстанавливать равновесие экосистемы кишечника.

Концентрат «Наринэ» -лиофилизированная в среде культивирования микробная масса живого штамма Lactobacillus acidophilus новорожденных детей Армении с добавлением защитной среды сахаро-желатино-молочной. Препарат выпускается в виде порошка кремового цвета, кисломолочного вкуса, во флаконах и пакетах.

Пребиотики

Лактулоза (Lactulose)- синтетический дисахарид. Под влиянием препарата увеличивается количество лактобактерий, что приводит к повышению кислотности в просвете толстого кишечника; проявляется слабительный эффект без влияния на слизистую оболочку и гладкую мускулатуру кишечника. Лактулоза уменьшает образование и всасывание азотсодержащих токсичных веществ в проксимальном отделе толстого кишечника, не уменьшает абсорбцию витаминов, не вызывает привыкания. Форма выпуска – сироп, состоящий из лактулозы, галактозы, лактозы.

Пантотенат кальция. Утилизируетсябифидобактериями и способствует увеличению их массы.

Памба (парааминобензойная кислота). Способствует росту бифидо- и лактобактерий, кишечных палочек.

Хилак форте – концентрат метаболизма бактерий. Способствует восстановлению нормофлоры.

Нормазе (лактулоза)- синтетический дисахарид. Понижает рН в толстом кишечнике, снижает концентрацию гнилостных бактерий, стимулирует перистальтику и рост бифидобактерий.

Лизоцим (Lysocim) – мукополисахаридаза, фермент белковой природы. Препарат оказывает бактериолитическое действие, разрушает полисахариды микробной клетки, подавляет рост грамположительных бактерий, стимулирует неспецифическую реактивность организма, оказывает противовоспалительное и муколитическое действие.

Контрольные вопросы

1. Положительные функции нормофлоры кишечника человека.

2. Причины, вызывающие дисбактериоз.

3. Пробиотики, пребиотики, симбиотики, особенности каждой группы.

4. Микроорганизмы, используемые для создания эубиотиков.

5. Препараты эубиотиков.

Лекция 24