Частная технология антибиотиков

Форма проведения лекции: информационная

План лекции

1. Химическая трансформация природных антибиотиков – полусинтетические препараты.

2. Схема технологии производства пенициллина как пример промышленного получения антибиотиков.

3. Проблема резистентности к антибиотикам.

1. Пенициллины и цефалоспорины - большая группа лекарственных препаратов, имеющих определенное сродство химического строения, механизмов действия, фармакологических, клинических эффектов. Эти препараты называют Р-лактамными антибиотиками, что обусловлено наличием в их структуре общего для всей группы четырехчленного лактамного кольца.

Все пенициллины имеют одинаковое строение основной группы, которая представлена тиазолидиновым кольцом, соединенным с (3-лак-тамным кольцом, и имеющим аминогруппу - 6-аминопеницилановая кислота (6-АПК).

 

 

Различные пенициллины (G, X, F, К и др.) отличаются строением радикала молекулы боковой цепи (табл. 3), активностью и спектром действия. Важные, с точки зрения клинического использования, пред­ставители пенициллинов можно разделить на несколько групп:

- обладающие наивысшей активностью в отношении грамположительных микроорганизмов и слабой в отношении грамотрицательных видов, а также гидролизуемые b-лактамазам (пени­циллин G);

- относительно резистентные к действию b -лактамаз стафилокок­ков, но с более низкой активностью в отношении грамположительных микроорганизмов и не действующие на грамотрицательные (нафициллин, метациллин);

- относительно высокоактивные против грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, но разрушаемых b-лактамазами (карбенициллин, тикарциллин);

- препараты с относительной кислотоустойчивостыо и пригодные для перорального применения (пенициллин V, ампициллин, клоксациллин).

Структурное единство ядра 6-АПК существенно для проявления биологической активности молекул. При ферментативном расщеплении b-лактамного кольца бактериальными b-лактамазами (пенициллиназами) с образованием неактивной пенициллановой кислоты антибиотик лишается своих антимикробных свойств.

 

Таблица 3

Различные типыпенициллинов и строение их радикалов

Название пенициллина	Строение радикала при аминогруппе 6-АПК	Активность натриевых солей против Micrococcus pyogenes, ед/мг
общепринятое	условное
Бензилпени-циллин	G
n-Оксибензил-пенициллин	X
2-Пенте-нилпен-мициллин	F	СН3-СH2-СН=CН-СН2-СО-6-АПК
n-Гептилпени- циллин	К	СН3-(СН2)5-СН2-СО-6-АПК
n-Амилпени- циллин	Дигидро F	СН3-(СН2)3-СН2-СО-6-АПК
Феноксиме-тилпеницил-лин	V
Аллилмеркап-тометилпени-пиллин	О	CH2=CH-CH2-S-CH2-6-AПК

Задачей получения новых пенициллинов является разработка препаратов, устойчивых к b-лактамазам или со сниженной способностью к индукции синтеза b-лактамаз. Для предотвращения возникновения резистентных форм бактерий к b-лактамным антибиотикам получены липосомальные формы этих ан­тибиотиков (защита антибиотика происходит в результате включения b-лактама в положительно заряженные липосомы). Комплекс антибио­тик - липосома обладает рядом преимуществ:

- снижается токсичность препарата за счет направленного транс­порта;

- повышается проникновение антибиотиков через внешнюю мем­брану грамотрицательных бактерий;

- антибиотик, включенный в липосомы, защищен от действия b-лактамоз;

- повышается химическая стабильность антибиотика.

Для промышленного производства антибиотика используют куль­туру Penicillium chrysogenurn и среду, содержащую кукурузный экс­тракт, гидрол, лактозу и минеральные соли.

Вместо кукурузного экстракта может быть применена арахисовая мука, жмыхи, мука из хлопковых семян и другие источники; возмож­ность широкого использования продуктов растительного происхожде­ния обусловлена тем, что у P. chrysogenum имеются сильные протеолитические ферменты. В качестве углеводов часто используют сахарозу или смесь лактозы с глюкозой в соотношении 1:1. Глюкоза может сни­жать биосинтез антибиотика; на средах, содержащих лактозу или саха­розу (в условиях депрессии), биосинтез антибиотика идёт активнее. Важную роль в процессе биосинтеза пенициллина играет сера, которая содержится в структуре антибиотика. В качестве источников серы ис­пользуются натрия сульфат и натрия тиосульфат. Избыток ионов меди не влияет на рост гриба, но подавляет биосинтез пенициллина. Эффект торможения биосинтеза снимается добавлением в среду ионов железа. P. chrysogenum в качестве источника фосфора может использовать не только фосфаты, но и фитаты (соли инозитфосфорных кислот): этот продуцент содержит фермент, разрушающий фитин с освобождением неорганического фосфора.

Температура в период первой фазы должны быть 30 °С, во вторую фазу 20 °С, рН в период роста гриба — ниже 7,0, потребление углеводов должно быть медленным, что достигается использованием лактозы, ли­бо дробным внесением глюкозы.

2. Синтез того или иного пенициллина зависит от наличия специфич­ного вещества в среде, иначе говоря, предшественника, который мик­роорганизм включает в молекулу антибиотика без предварительного расщепления. Следует отметить, что предшественники биосинтеза пе­нициллина (фенилуксусная кислота, фенилацетамид, феноксиуксусная кислота) при определённых концентрациях и рН среды оказывают ток­сическое влияние на продуцента. Фенилуксусная кислота наименее ток­сична. Добавление её в среду в концентрации выше 500 мкг/мл угнетает рост мицелия, особенно в первые 24 ч его развития. Фенилуксусная ки­слота добавляется в концентрации от 100 до 500 мкг/мл через 24 ч раз­вития P. chrysogenum, При таких условиях обеспечивается наибольший выход бензилпенициллина, который через 72 ч развития может дости­гать 500-1000 мкг/мл.

При развитии гриба без внесения предшественника образуется около 45% бензилпенициллина (пенициллин G) и около 53% пеницил­лина К (радикал - n-гептилпенициллин). При добавлении к среде фенилуксусной кислоты (С₆Н₅СН₂СООН) меняется соотношение образую­щихся компонентов в сторону резкого увеличения бензилпенициллина, количество которого в зависимости от возраста достигает 75 – 99 % от смеси пенициллинов. В процессе культивирования P. chrysogenum в среде, не содержащей фенилуксусной кислоты, в ней накапливаются серосодержащие соединения не b-лактамного характера, близкие к цистеину и метионину. Добавление в среду фенилуксусной кислоты способствует более интенсивному метаболизму серосодержащих компо­нентов в соединения b-лактамного характера.

При развитии продуцента пенициллинов - гриба P. chrysogenum - на кукурузно-лактозной среде выделяют три фазы.

Первая фаза - рост мицелия, выход антибиотика низок. Всегда при­сутствующая в кукурузном экстракте молочная кислота потребляется продуцентом с максимальной скоростью, лактоза используется медлен­но. Потребление кислорода высокое. Усиливается азотный обмен, в ре­зультате в среде появляется аммиак и резко поднимается значение рН.

Вторая фаза - максимальное образование пенициллина, это связано с быстрым потреблением лактозы и аммонийного азота. рН среды оста­ётся почти без изменений, увеличение массы мицелия незначительное, потребление кислорода снижается.

Третья фаза — снижение концентрации антибиотика в среде в связи с начавшимся автолизом мицелия и выделением в результате этого про­цесса аммиака, что сопровождается повышением рН среды.

В настоящее время описано шесть условно выраженных возрастных фаз продуцента пенициллина. Заметное количество пенициллина начи­нает образовываться с IV возрастной фазы гриба, максимум накопления приходится на VI фазу - в период автолиза.

Определение возрастных фаз путём микроскопического контроля по­зволяет установить: 1) ход общего темпа развития гриба, его состояние, пригодное для использования посевного материала, контроль за ходом образования антибиотика; 2) дефекты развития и возможные причины этих дефектов; 3) момент окончания развития гриба в реакторе.

По мере развития гриба меняется и химический состав мицелия. Количество общего азота и белка в мицелии уменьшается, содержание моносахаров в период максимального биосинтеза пенициллина (96 ч) увеличивается почти в 6 раз по сравнению с начальным периодом, ко­личество дисахаридов уменьшается. Изменяется количество отдельных аминокислот.

Процесс биосинтеза пенициллина ведётся при самом тщательном соблюдении стерильности всех операций, так как загрязнение культур посторонней микрофлорой резко снижает накопление антибиотика. Это связано с тем, что многие бактерии воздуха способны образовывать пенициллиназу. Особенно активно продуцируют этот фермент В. subtilis и В. cereus. Одним из активных продуцентов пенициллиназы является туберкулёзная палочка (Mycob. tuberculosis). Предположительно именно с этим свойством связана резистентность этого микроорганизма к пенициллину.

Механизм биосинтеза молекулы пенициллина представлен на схеме.

Современная промышленная микробиология получает культуральные жидкости, содержащие свыше 55 тыс. ед/мл. Выделение пеницил­лина начинается с фильтрации или центрифугирования (отделения ми­целия гриба).

 

 

Из культуральной жидкости антибиотик, где он находится в виде кислоты, выделяют путём экстракции неполярными органическими растворителями (амилацетатом, хлороформом, бутилацетатом, бутанолом и др.). Очистку антибиотика проводят путём замены растворителей, поскольку соли пенициллина плохо растворимы в органических раство­рителях. Экстрагированный пенициллин в виде кислоты переводят в водный раствор в виде соли, добавляя щёлочь. Повторяя эти операции, пенициллин концентрируют и очищают. Большинство пенициллинов производят в виде натриевых или калиевых солей. Новокаиновые и бензатиновые соли являются основой пролонгированных препаратов пени­циллина для внутримышечного введения.

В сухой кристаллической форме пенициллиновые соли достаточно стабильны в течение длительного времени при температуре 4 °С. Растворы быстро теряют активность (в течение 24 часов при температуре 20 °С), их готовят непосредственно перед введением.

В настоящее время большое практическое значение имеет полусин­тетический (биологический + химический) способ получения аналогов природного пенициллина. Исходным продуктом служит 6-аминопенициллановая кислота (6-АПК).

6-АПК получают в результате биосинтеза при развитии P. chrysogenum при отсутствии предшественника в среде или путём фермента­тивного дезацилирования бензилпенициллина или "феноксиметилпенициллинапри участии фермента пенициллинацилазы (пенициллинамидазы). Второй способ наиболее перспективен. Используется иммобилизо­ванная пенициллинацилаза, которая гидролизует бензилпенициллин с образованием 6-АПК и фенилуксусной кислоты. Пенициллинацилаза образуется различными группами микроорганизмов, в том числе она образуется всеми продуцирующими пенициллин грибами. В настоящее время предложен способ получения иммобилизованных клеток Е. coli с высокой пенициллинацилазной активностью, пригодных для много­кратного применения.

Сама по себе 6-АПК не активна. Её подвергают химическому аци-лированию и получают аналоги пенициллина с улучшенными или но­выми свойствами; некоторые из них: оксациллин, ампициллин, метициллин, амоксициллин и другие. Всего в настоящее время используется порядка четырёх десятков таких препаратов.

В настоящее время бензилпенициллин необходим не только как ме­дицинский препарат, но и как вещество, являющееся исходным продук­том для получения 6-АПК и в дальнейшем полусинтетических пенициллинов. Из общего количества природных пенициллинов примерно 35 % используется как медицинские препараты, а 65 % - для получения 6-АПК.

В начале 60-х гг. были предприняты попытки химического синтеза пенициллинов, в частности был синтезирован феноксиметилпенициллин, но практического значения эти попытки не имели.

Большинство пенициллинов производят в виде натриевых и калие­вых солей. Новокаиновые и бензокаиновые соли являются пролонгиро­ванными формами для внутримышечного введения. В сухой кристалли­ческой форме пенициллиновые соли достаточно стабильны при темпе­ратуре 4 °С. Растворы быстро теряют активность (в течение 24 ч при температуре 20 °С), их готовят непосредственно перед введением. Пероральные пенициллины применяют за 1 ч до или через 2 ч после прие­ма пищи, чтобы снизить связывание компонентами пищи и кислотную инактивацию препаратов.

Цефалоспорин — антибиотик из грибов рода Cepholosporium. Ос­новным продуцентом является С. acremonium.

Впервые сообщение было сделано Джузеппе Бротцу в 1948 г. В культуральной жидкости было обнаружено несколько цефалоспоринов, основной из которых - цефалоспорин С. На основе этого антибиотика в дальнейшем были созданы многочисленные полусинтетические цефалоспорины с ценными свойствами.

По химическому строению цефалоспорин принадлежит к (b-лактамным соединениям, но b-лактамное кольцо конденсировано не с пяти, а с шестичленным гетероциклом. Цефалоспорины в отличие от пеницил­линов устойчивы к b-лактамазе, подавляют развитие и грамположительных и грамотрицательных бактерий, но активность этого антибио­тика ниже пенициллина.

Цефалоспорин не инактивируется пенициллиназой. Но имеется ана­логичный фермент, гидролизующий b-лактамное кольцо цефалоспорина - цефалоспориназа.

В процессе развития С. acremonium наряду с цефалоспорином С синтезируется и пенициллин N. Его образование идёт тем же путём, что и образование изопенициллина N в процессе биосинтеза бензилпени­циллина. Через ряд стадий из изопенициллина N образуется цефалоспо­рин С.

Все пенициллины и цефалоспорины являются селективными инги­биторами синтеза клеточной стенки. Первый этап действия препаратов заключается в их связывании с клеточными рецепторами; такими ре­цепторами являются пенициллинсвязывающие протеины (ПСП), коли­чество которых составляет от 3 до 6 тыс. у различных бактерий. От­дельные ПСП могут иметь неодинаковый аффинитет к препарату, и ка­ждый из них может опосредовать различное действие. Так, присоедине­ние пенициллина к одному ПСП может вызывать аномальное увеличе­ние клетки, присоединение к другому — приводить к дефекту на по­верхности клеточной стенки без последующего лизиса клетки. ПСП контролируется хромосомами, мутации могут изменить их количества и аффинитет к отдельным b-лактамным препаратам. После связывания b-лактамнного препарата с рецепторами ПСП ингибируется реакция транспепдидирования и останавливается синтез пептидогликана. Следующий этап - устранение или инактивация ингибитора аутолитических энзимов (гидролаз) в клеточной стенке, что сопровождается ак­тивизацией логического фермента у некоторых микроорганизмов и мо­жет привесити к лизису клетки.

В последние годы методом смешанного (биологического и химиче­ского) синтеза удалось получить около 50 тыс. аналогов цефалоспорина. Примерно 50 антибиотиков имеет практическое клиническое значе­ние. Цефалоспорины традиционно делят на четыре поколения по спек­тру действия и антимикробной активности (табл. 4).

 

Таблица 4. Характеристика цефлоспоринов различных поколений

 

Поколение	Препараты	Спектр активности
I	Цефадроксил, цефазолин, цефалексин, цефалотин, цефапирин, цефрадин	Стафилококки, стрептококки, пневмококки, энтеробактерии
II	Цефаклор, Цефамандол, Цефоницид, Цеокситин, Цефметазол, цефотетан, цефуроксим, цефпрозил, лоракарбеф, цефподоксим	Грамотрицательные бактерии, устойчивые к действию b-лактамаз
III	Цефаперазон, цефотаксим, цефазидим, цефтизоксим, цефтриаксон, цефиксим, максал актам	Энтеробактерии, в т.ч. устой­чивые к другим антибиотикам. Устойчивы к действию b-лактамаз, образуемых гра-мотрицательными бактериями
IV	Цефипин	Низкое сродство к b-лактамазам, быстро проникает в периплазматическое пространство

Стрептомицин принадлежит к группе аминогликозидных анти­биотиков.

Актиномицет, синтезирующий стрептомицин Streptomyces griseus впервые был выделен в лаборатории микробиологии Ратжерского уни­верситета в 1943 г. С появлением стрептомицина медицина получила мощное оружие для борьбы с таким тяжёлым и достаточно широко рас­пространённым заболеванием, как туберкулёз. Поэтому детально разра­батывались вопросы применения стрептомицина в терапии различных инфекционных заболеваний и его промышленного производства.

Стрептомицин продуцируют ряд видов актиномицетов рода Streptomyces. Однако основным продуцентом стрептомицина признан S. griseus, способный синтезировать до 10-20 тыс мкг/мл антибиотика. Культуры актиномицетов весьма вариабельны и каждому штамму должна соответствовать определённая среда и свой режим для развития микроорганизма. На их изменчивость влияют условия культивирования и особенно состав сред (на более богатых по составу средах наблюдает­ся и более быстрая изменчивость). Изменчивость продуцентов стрепто­мицина — результат генетической нестабильности этих микроорганиз­мов, обусловленный существенными перестройками ДНК, которые за­трагивают многие гены, в том числе и гены биосинтеза антибиотиков и гены устойчивости к ним.

Для стабилизации признаков, связанных с антибиотикообразованием, при хранении и поддержании штамма иногда в среды добавляют антимутагены - вещества, способные стабилизировать процессы, при­водящие к хромосомным перестройкам и регуляции экспрессии генов. Среди антимутагенов — пуриновые нуклеотиды, ионы марганца, L-метионин, гистидин, полиамины, кофеин и другие соединения. В кон­троле биосинтеза стрептомицина S. griseus принимает участие плазмидная ДНК, в процессе биосинтеза - 20-30 генов.

При промышленном производстве стрептомицина используются штаммы, хорошо развивающиеся на соевых средах, их основными ком­понентами является соевая мука, гидрол, аммонийные соли. Сущест­венную роль в биосинтезе стрептомицина играют жиры соевой муки и её минеральный состав. Белок сои и его кислотный гидролизат мало­пригодны для биосинтеза антибиотика.

Аэрация среды имеет существенное значение, так как S. griseus -высокоаэробный организм и поглощает значительное количество ки­слорода, которое зависит от состава среды и стадии развития продуцен­та. В ранний период развития актиномицета потребление кислорода воздуха более интенсивное, а затем оно падает до нуля. Увеличение степени аэрации повышает выход стрептомицина. В анаэробных усло­виях продуцент стрептомицина развивается слабо. Мицелий, выращен­ный в аэробных условиях и перенесённый затем в анаэробные, стрепто­мицина не образует. Для максимального накопления антибиотика куль­тура должна находиться в условиях непрерывной аэрации.

Оптимальная температура для развития антибиотика 27—29 °С. По­вышение её до 30 °С и выше резко снижает и даже прекращает его образование. Оптимальную температуру меняют в зависимости от штамма продуцента и состава среды.

Лучшим начальным рН для развития актиномицета является 7,0. Стрептомицин образуется при значении рН от 7,5 до 8,5. В кислых сре­дах активность стрептомицина снижается, в щелочных - максимальная. Так, активность стрептомицина при рН 5,8 в 20-80 раз меньше, чем при рН 8,0. Для проявления максимальной антимикробной активности стрептомицина оптимальное значение рН 7,5-8,0.

Наличие некоторых веществ в среде влияет на антибиотическую ак­тивность стрептомицина. Если к этой среде прибавить 0,5-3 % натрия хлорида, калия хлорида или натрия сульфата, Е. coli развивается в при­сутствии 10 мкг/мл стрептомицина. Имеется два объяснения этому фак­ту: в присутствии натрия хлорида уменьшается скорость и степень диффузии стрептомицина, или натрия хлорид снижает адсорбцию анти­биотика бактериальной клеткой. При концентрации пировиноградной, фумаровой кислот до 1 % продуцент развивается в присутствии 10 мкг/мл стрептомицина, если концентрацию солей повысить до 3 %, рост бактерий наблюдается при концентрации антибиотика 150 мкг/мл. Защитные свойства этих кислот по-разному проявляются по отношению к различным микроорганизмам. В отношении Е. coli защитные свойства проявляются в большей степени, в отношении Staph. aureus защитных свойств не наблюдается. Сильно снижается активность стрептомицина в присутствии цистеина и гидроксиламина (цистеин полностью инактивирует антибиотик в течение нескольких часов).

При развитии продуцента различают две основные стадии. На пер­вой стадии идёт быстрый рост и развитие микроорганизма с энергич­ным использованием основных компонентов субстрата, максимальное потребление кислорода. В цитоплазме высокое содержание РНК, ДНК вначале отсутствует и обнаруживается только через 12 ч развития. В среде происходит некоторое увеличение аммонийного азота, связанное с разложением белков соевой муки. рН вначале несколько снижается, затем повышается с 6,8 до 7,9. Образование стрептомицина незначи­тельное.

Через 28 ч масса мицелия прекращает увеличиваться, начинается вторая стадия — процесс образования стрептомицина. На третьи сутки рН с 7,9 падает до 6,7, а на четвёртые и пятые — вновь возрастает до 7,7. Вторая стадия характеризуется медленным потреблением оставшихся в среде питательных веществ, замедлением роста актиномицета, сниже­нием потребления кислорода, автолизом мицелия, максимальным образованием стрептомицина. Максимальное накопление стрептомицине наблюдается, когда автолитические процессы начинают преобладать над процессами роста. Количество аммонийного азота продолжает воз­растать, что, по всей вероятности, связано с разложением белков соевой муки и автолизом мицелия. В культуральной жидкости находятся мине­ральные вещества, белки, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, поли­сахариды, жиры, стрептомицин и другие вещества.

S. griseus при определённых условиях развития культуры образует ещё один антибиотик — маннозидострептомицин (стрептомицин В), в чистом виде выделенный в 1947 г. из культуры актиномицета методом противоточной хроматографии. Маннозидострептомицин отличается от стрептомицина наличием в молекуле маннозы. Он менее активен, чем стрептомицин. Культуры S. griseus содержат фермент, превращающий маннозидострептомицин в стрептомицин. При соответствующем кон­троле развития культуры актиномицета можно добиться минимального образования маннозидострептомицина.

Основная часть стрептомицина выделяется в культуральную среду, но часть его остаётся в мицелии и на его поверхности. С целью извле­чения стрептомицина из микроорганизма культуральную жидкость вме­сте с биомассой обрабатывают минеральной кислотой. При этом весь антибиотик переходит в раствор. Мицелий отделяют прессованием или центрифугированием. Свободную от мицелия культуральную жидкость обрабатывают щавелевой кислотой. Этим достигается удаление белков и органических оснований, ионов металлов (кальция, магния, железа), далее ведётся выделение стрептомицина в чистом виде.

Стрептомицин - сильно, полярное соединение и его основание и со­ли неорганических кислот хорошо растворимы в воде. Соли же органи­ческих кислот стрептомицина нерастворимы почти во всех органиче­ских растворителях.

Для выделения стрептомицина из культуральной жидкости в чистом виде используются методы адсорбции на активированном угле и метод ионообменной хроматографии.

В основу первого метода положена адсорбция стрептомицина на ак­тивированном угле при нейтральном или слабощелочном рН среды. При рН 2-4стрептомицин остаётся в растворе, в то время как примеси адсорбируются на сорбент. После удаления примесей на активирован­ный уголь адсорбируют из подщелоченной среды антибиотик, его де­сорбцию осуществляют этанолом, подкисленным кислотой хлороводородной. Далее в раствор добавляется диэтиловый эфир - стрептомицин выпадает в осадок.

Стабильность стрептомицина имеет значение для производства и хранения антибиотика. Она зависит от чистоты препарата, влажности, температуры, рН растворителя. Химически чистый стрептомицин ус­тойчив в сухом состоянии и в виде растворов. Соли стрептомицина при хранении при комнатной температуре инактивируются лишь в незначи­тельной степени на протяжении нескольких лет. Максимальная ста­бильность растворов стрептомицина сульфата и гидрохлорида находит­ся при рН от 3,0 до 7,0 при температуре от 7 до 25 °С.

По отношению к стрептомицину микроорганизмы условно делятся на 3 группы:

1. Чувствительные, рост которых подавляется при концентрации стрептомицина 10 мкг/мл, это роды Bacillus, Bordetella, Brucella, Klebsiella, Mycobacterium, Staphylococcus и некоторые другие.

2. Умеренно чувствительные, для подавления которых in vitro не­обходима концентрация антибиотика от 10 до 100 мкг/мл, сюда относят многие бактерии из родов Enterobacter, Corinebacterium, Diplococcus, Proteus, Streptococcus, Vibrio.

3. Устойчивые, для подавления которых необходима концентра­ция стрептомицина, превышающая 100 мкг/мл. К этой группе относят роды Bacteroides, Clostridium, некоторые виды Proteus, многие виды грибов, дрожжей, риккетсии, вирусы.

К стрептомицину легко возникает вторичная резистентность. По­вышение устойчивости к нему в 1000 раз возникает у золотистого ста­филококка всего лишь через три пассажа на бульоне с возрастающими концентрациями антибиотика, а у Salmonella typhi повышение устойчи­вости после 14 пассажей наб-людается в 22 600 раз.

При лечении стрептомицином необходимо учитывать его побочные эффекты, могут появиться глухота, вестибулярные и другие нарушения функций. Их развитие определяется длительностью периода лечения, дозой антибиотика, методами введения, степенью очистки. Токсичность менее очищенных препаратов стрептомицина первого периода получе­ния и применения стрептомицина была более высокой, что связано с наличием в препаратах гистаминоподобных веществ, которые сами дос­таточно токсичны.

Грамицидин С. Продуцент Bacillus brevis способен синтезировать полипептидные антибиотики, к числу которых относят грамицидины А, В, Со, D, С. Последний иногда обозначают как грамицидин S (советский грамицидин). Все они отличаются как по аминокислотному соста­ву, так и по пространственной структуре молекулы.

Для производства грамицидина С (S) предложены среды на основе мясного и дрожжевого гидролизатов, содержащие сбалансированный набор минеральных и органических солей.

В процессе культивирования необходимо подобрать сбалансирован­ное сочетание интенсивности аэрации среды (от 0,38 до 4,38 г О₂/(л/ч)) и концентрации входящих в неё веществ. Температура культивирования - 40 °С. Развитие продуцента и синтез антибиотика может идти и при температуре 28 °С, но в этом случае максимальный биосинтез антибио­тика наблюдается в первые 24 ч, в то время, как при температуре 40 °С - между 24 и 48 ч.

При выделение грамицидина С культуральную жидкость подкисля­ют кислотой хлороводородной до рН 4,5-5,0. В осадок выпадает дихлоргидрат грамицидина С вместе с бактериальными клетками проду­цента. Из осадка антибиотик экстрагируют этанолом. Концентрат, со­держащий 4 % грамицидина, используется в медицинской практике.

Неомицины. В 1949 г. 3. Ваксман и X. Лешевалье из культуры Streptomyces fradiae выделили неомицин. В дальнейшем было установ­лено, что это комплекс, состоящий из семи антибиотиков аминогликозидного строения.

На синтетической среде актиномицет развивается лучше, чем на среде с соевой мукой, но биосинтез неомицина на синтетической среде почти в 8 раз ниже, чем на натуральной среде неопределённого состава. Некоторые вещества способствуют повышению выхода неомицина на 50 %. К ним относятся ауксин, a-нафтилуксусная кислота. Наиболее эф­фективная доза ауксинов - семь частей на миллион, внесённая в среду перед стерилизацией. Стимулирующий эффект ауксинов проявляется при продолжительности процесса 138-162 ч, в ранние сроки развития культуры эффект отсутствует.

В процессе образования антибиотика существенную роль играет цинк. Степень аэрации культуры должна быть несколько ниже, чем при выработке стрептомицина.

Неомицины - основания, хорошо растворимые в воде и нераство­римые в органических растворителях, наибольшая их антибиотическая активность проявляется в щелочной среде.

Неомициновый комплекс не теряет антимикробных свойств при длительном хранении (до 2-х лет) как в виде растворов, так и в твёрдом состоянии.

Антимикробный спектр сходен со спектром стрептомицина. Но неомицин подавляет развитие устойчивых к стрептомицину штаммов Муcobacterium tuberculosis. Он малоактивен в отношении большинства ви­дов Clostridium, Streptococcus, грибов, а также против вирусов и протозоа.

Чувствительные к неомицину микроорганизмы приобретают устой­чивость к нему в меньшей степени, чем к стрептомицину.

При использовании неомицина следует учитывать его токсичность. Для человека неомицин более токсичен, чем стрептомицин. Степень токсичности колеблется в зависимости от состава неомицинового ком­плекса и чистоты препарата.

3. Антибиотики считаются в основном бактериостатическими агентами, т.е. ингибиторами роста, хотя некоторые из них обладают выраженным бактерицидным или даже бактериолитическим действием. Многие антибиотики, например актиномицин, высокотоксичные по отношению к тканям животного организма и применяются только в качестве противоопухолевых препаратов; другие, в частности пенициллины, совсем нетоксичны либо (как стрептомицин) обладают лишь слабой токсичностью. Антибиотики широкого спектра действия (например, тетрациклины) нарушают нормальную микробную флору кишечника и могут вызывать желудочно-кишечные расстройства или способствовать вторичным инфекциям. Некоторые нерастворимы в воде и потому применяются лишь для лечения поверхностных или местных инфекционных процессов. Одни (например, тиротрицин) обладают гемолитическим действием, т.е. разрушают эритроциты; другие (например, имипимен), напротив, инактивируются клетками организма. (Фермент, инактивирующий имипимен, в настоящее время известен; введение имипимена вместе с ингибитором этого фермента позволяет сохранить высокую активность антибиотика по всему спектру действия.) Поскольку антибиотикам присуща избирательная антибактериальная активность, ни один из них не может применяться как общее дезинфицирующее средство против любых бактерий. Пенициллин и эритромицин активны в основном против кокковых форм и различных грамположительных бактерий, а стрептомицин – против туберкулезной палочки. Пенициллин и стрептомицин относительно слабо действуют на грибковую флору и вирусы, хотя первый обладает некоторой активностью против крупных вирусов, например против вируса пситтакоза, а второй – против некоторых риккетсий и возбудителей тропической паховой гранулемы. Однако ряд антибиотиков, в первую очередь тетрациклины, действуют на многие грамположительные и грамотрицательные бактерии, а также на риккетсии и крупные вирусы. Некоторые антибиотики обладают высокой противогрибковой активностью, тогда как другие – противоопухолевым действием.

Место приложения действия. Антибиотики отличаются друг от друга не только по химической структуре, но и по месту приложения действия на микробную клетку. Действие антибиотиков, применяемых в низких концентрациях, обычно направлено на специфические особенности жизнедеятельности патогенных микроорганизмов. Клеточные стенки бактерий и плесневых грибков сильно отличаются от клеточной оболочки животных клеток, и многие нетоксичные антибиотики блокируют образование именно клеточных стенок. Так действуют пенициллин, бацитрацин, циклосерин и цефалоспорины, применяемые в клинике при бактериальных инфекциях, а также гризеофульвин, который используется при кожных грибковых заболеваниях. Особо важную роль в жизнедеятельности бактериальной клетки играет ее плазматическая мембрана, расположенная под клеточной стенкой. Она регулирует прохождение в клетку питательных веществ и выход продуктов выделения, в ней протекают многие ферментативные процессы. Антибиотик полимиксин связывается с клеточной мембраной многих грамотрицательных бактерий и нарушает ее функцию. Тироцидин обладает химическими свойствами детергента и разрушает мембрану. На нее воздействует и стрептомицин: вновь синтезируемая мембрана оказывается дефектной, и клетка теряет жизненно важные для себя компоненты. Нистатин, связываясь с клеточными мембранами различных дрожжевых и плесневых грибков, приводит к потере их клетками необходимого элемента – калия. Во всех живых клетках происходит синтез белка. Хлорамфеникол специфически блокирует этот процесс у многих бактерий. Тетрациклины тоже блокируют белковый синтез, но не менее важной стороной их эффекта являются образование комплексов с металлами и влияние на связывание кальция, магния и марганца в клетке. На синтез белка воздействует также эритромицин. Изучение механизмов действия различных антибиотиков дало много полезных сведений о биохимических процессах, протекающих в клетках микроорганизмов. Даже те антибиотики, которые не применяются в лечебных целях, могут использоваться как важный инструмент биохимических исследований.

Поскольку клетки млекопитающих имеют совершенно другую, не содержащую пептидогликанов, оболочку, пенициллин практически не действует на них. Таким образом, пенициллин, как правило, абсолютно безвреден для человека, если не считать редких побочных эффектов, например тяжелых аллергических реакций.

Многие бактерии при длительном контакте с антибиотиками способны приспосабливаться к их действию; это приводит к появлению устойчивых штаммов таких бактерий. Так, культуры Staphylococcus aureus, первоначально чувствительные к пенициллину, могут стать резистентными к нему. Другие штаммы S. aureus вырабатывают фермент пенициллиназу, который разрушает пенициллин, и потому способны вызывать тяжелые инфекционные заболевания даже у лиц, получающих этот антибиотик. Туберкулезная палочка, Mycobacterium tuberculosis, будучи вначале чувствительной к стрептомицину, в ряде случаев адаптируется к нему. Некоторые штаммы микроорганизмов приобретают устойчивость к нескольким антибиотикам. В последние годы многие врачи высказывают опасения, что повсеместное увлечение антибиотиками резко снижает их эффективность при лечении гонореи, брюшного тифа, пневмококковой пневмонии, туберкулеза, менингита и других тяжелых заболеваний.

Контрольные вопросы

1. Какова биологическая роль антибиотиков как вторичных метаболитов?

2. Как накопление антибиотика – целевого продукта согласуется с накоплением биомассы?

3. Каковы пути создания высокоактивных продуцентов антибиотиков?

Лекция 21