Биотехнология стероидных гормонов

Форма проведения лекции: проблемная

 

План лекции

1. Традиционные источники получения стероидных гормонов.

2. Проблемы трансформации стероидных структур.

3. Преимущества биотрансформации перед химической трансформацией.

 

1. Несмотря на разнообразие биотрансформаций стероидов, методы проведения микробиологических реакций довольно единообразны. При поисковых работах, где не требуется или нет возможности применять большие количества вещества, ограничиваются проведением реакции в колбах на качалках, загрузка стероида в колбу составляет 100 - 200 мг. Для загрузок порядка 1-2 г стероида применяют стеклянные ферментеры. В промышленности и на опытных установках применяют стальные аппараты, оборудованные аэрирующими и перемешивающими устройствами.

Собранный стеклянный ферментер стерилизуют и загружают стерильной питательной средой с заранее внесенной в нее в асептических условиях трансформирующей культурой. Особое внимание уделяют наблюдению асептики во всех операциях. Стерилизацию в зависимости от объекта осуществляют автоклавированием питательной среды при 110 - 120⁰С в боксах, освещаемых бактерицидными лампами. Операции по загрузке, отбору проб проводят в пламени газовой горелки. Загрузка питательной среды в ферментер, как правило, осуществляется передавливанием стерильным сжатым воздухом. Время роста культуры микроорганизма-трансформатора определяется появлением максимальной трансформирующей активности и может колебаться от нескольких часов для одних культур до нескольких суток для других. Для многих культур-трансформаторов характерна максимальная трансформирующая активность в период снижения удельной скорости роста культуры.

Растворимость стерилов в воде очень низка. В настоящее время стерины, предназначенные для окисления, в небольшой концентрации (порядка 1 г/л) вносят растворенный в малотоксичном, смешивающемся с водой растворителе (ацетоне, спирте, диметилформамиде). При более высоких концентрациях стеринов (выше 1 г/л) их вносят в среду в виде мелкоизмельченной пудры; для этого кристаллы стерина растирают в специальной аппаратуре или разрушают ультразвуком.

Другой способ внесения стеринов для биотрансформации состоит в том, что стерин, например, рептостерин, растворяют в смеси гептан/этиленхлорид, добавляют при перемешивании воду и отгоняют растворитель нагреванием смеси до 95⁰С. При таком методе концентрация ситостерина в водной суспензии может достигать 140 г/л.

Трансформация стеринов микроорганизмами основана на их использовании в качестве источника углерода, поэтому стимуляция роста трансформирующих штаммов должна приводить к увеличению выхода продуктов расщепления стеринов. Процесс стимулируется насыщением среды кислородом. Добавление в питательную среду некоторых масел в количестве 1-3 мас.% (соевого, арахисового, рапсового, оливкового) повышает выход продукта трансформации. Аналогичные результаты получены с применением глицеридов животного и растительного происхождения (тристеарин, триолеин, трипальмитин). Механизм стимуляции роста глицеридами, вероятно, состоит в устранении гидрофобности стеринов, глицериды действуют так же, как истинные ПАВ, обычно применяемых для микробиологических процессов трансформации. Температурный режим микробиологических трансформаций стероидов не отличается от принятых для других микробиологических процессов и составляет 24 - 33⁰С. Условия рН определяются при отборе штамма культуры-трансформатора и колеблются в широком интервале.

2. Микробиологический контроль осуществляется только на стадии выращивания трансформирующей культуры. Аналитический контроль реакции трансформации ведется путем отбора проб через определенные временные интервалы и анализа их методом тонкослойной хроматографии на силуфоле в присутствии «свидетелей» исходного стероида, целевого продукта трансформации и некоторых промежуточиых и побочных продуктов, если они участвуют в данном процессе.

После завершения трансформации культуральная жидкость, отделенная от мицелия (или другой биомассы), экстрагируется несмешивающимся с водой органическим растворителем, пригодным для растворения соответствуюшего стероида (этилацетат, метиленхлорид или хлороформ). Экстракт, отделенный от водной фазы, проходит требуемую очистку (окрашенные примеси обычно отделяют обработкой с активировинным углем, затем уголь отфильтровывают). Далее его концентрируют в вакууме и полученный осадок стероида перекристаллизовывают из подходящего растворителя. В препаративных целях при работе с небольшими количествами стероидов очистку продукта трансформации можно проводить методом колоничной хроматографии.

3. Специфической особенностью процесса микробиологических трансформаций является использование чистых культур микроорганизмов-трансформаторов. Поэтому необходимым условием технологического режима является соблюдение мер для предотвращения развития посторонней микрофлоры. Последняя постоянно присутствует в воздушных потоках, циркулирующих в производственных помещениях, и представлена в основном мезофильными микроорганизмами, оптимальная температура развития которых находится в пределах 24 - 30 ^оС. Такой же температурный оптимум характерен, как правило, и для микроорганизмов-трансформаторов.

Все операции по подготовке и выращиванию трансформирующих культур проводят в стерильных условиях с соблюдением правил и норм, разработанных и утвержденных для производста микробного синтеза. Однако внесение стероидного субстрата на трансформацию (в растущую на полноценной питательной среде культур при использовании бактерий или в водную суспензию неразмножающихся клеток в случае применения грибного мицелия) и сам процесс трансформации, как правило, проводят не стерильно. Для уменьшения вероятности загрязнения используют стерильную воду при приготовлении суспензии стероидных субстратов, поскольку сами стероиды обычно неустойчивы в условиях автоклавирования. Одним из вариантов решения этой проблемы может служить способ внесения стероидного субстрата в питательную среду и засева ее трансформирующей культурой в момент, когда температура среды после автоклавирования снизится до 80 ^оС и безопасна для субстрата. После выдержки в течение 30 мин. среду со стероидом охлаждают до 33 ^оС и в нее стерильно вносят трансформирующую культуру.

Используют культуру-трансформатор в стадии замедления роста, когда питательные компоненты среды в значительной степени израсходованы, а сильно разросшаяся культура подавляет рост других микроорганизмов. Однако и эти меры не полностью предохраняют трансформационную среду от загрязнения посторонней микрофлорой. В последней могут оказаться виды, способные отрицательно влиять на ход трансформации.

Применяемая в лабораторных условиях стерилизация суспензий стероидов ультразвуком неприемлема для промышленных масштабов.

Контрольные вопросы

1. Какие химические модификации стероидной молекулы осуществляются с помощью биотрансформации?

2. Биотрансформация, особенности процесса.

 

Лекция 25

Биотрансформация стероидных гормонов

Форма проведения лекции: проблемная

 

План лекции

 

1. Штаммы микроорганизмов, обладающие способностью к трансформации (биоконверсии) стероидов.

2. Конкретные реакции биоконверсии стероидов. Подходы к решению селективности процессов биоконверсии.

3. Микробиологический синтез гидрокортизона, получение из него путем биоконверсии преднизолона.

 

1. Специфической особенностью процесса микробиологических трансформаций является использование чистых культур микроорганизмов-трансформаторов. Поэтому необходимым условием технологического режима является соблюдение мер для предотвращения развития посторонней микрофлоры. Последняя постоянно присутствует в воздушных потоках, циркулирующих в производственных помещениях, и представлена в основном мезофильными микроорганизмами, оптимальная температура развития которых находится в пределах 24 - 30 ^оС. Такой же температурный оптимум характерен, как правило, и для микроорганизмов-трансформаторов.

Все операции по подготовке и выращиванию трансформирующих культур проводят в стерильных условиях с соблюдением правил и норм, разработанных и утвержденных для производста микробного синтеза.

2. Примеры промышленного ислользования микробиологических трансформаций. Получение гидрокортизона (кортизола) из вещества Sосуществляется с помощью С. lіnаtа.

 

 

Процесс включает следующие стадии:

1. Выращивание трансформирующей культуры (I стадия) производят путем трех последовательных генераций на питательной среде, содержащей сахарозу, дрожжевой автолизат и сложный набор неорганических солей:

лабораторный инокулят 1 – генерации, инокулят 2-й, инокулят 3-й генерации.

Крышку инокулятора перед засевом обрабатывают водным раствором формалина, аппарат и все помещение облучают бактерицидной лампой и весь процесс выращивания трансформирующей культуры проводят в стерильных условиях. Далее полученная трансформирующая культура поступает в сепаратор, откуда отделенный мицелий в виде водной суспензии передается в ферментер для проведения основной реакции трансформации вещества S.

2. Трансформация вещества (II стадия) также начинается со стерилизации ферментера и воздушного фильтра водным раствором формалина. Особое внимание уделяется размолу стероида на микромельнице и получению суспензии его в стерильной воде с содержанием стероида 1 г/л. Для предотвращения развития посторонней микрофлоры используется добавка антибиотика. Перемешивание и аэрация осуществляются, как и на предыдущей стадии, так же используются и пеногасители.

3. Выделение продукта трансформации - гидрокортизона (ІІІ стадия). Культуральная жидкость вместе с мицелием после ІІ-й стадии поступает на сепарацию. Отделенный мицелий промывается, промывные воды присоединяются к основной культуральной жидкости. Далее производится экстракция-сепарация продукта трансформации из водной среды органическим растворителем. Осветленный активированным углем экстракт подвергается многократному упариванию с различными растворителями, осветлению, снова упариванию досуха и промывке подходящим растворителем. Последние приемы обработки готового технического продукта обычны для технологии получения многих органических веществ и лекарственных препаратов. Получение чистых лекарственных форм гидрокортизона проводится традиционными методами.

Трансформация гидрокортизона в преднизолон:

 

Выращивание трансформирующей культуры М. globiformeосуществляется такими же последовательными этапами и в тех же аппаратах при тех же условиях аэрации и перемешивания, далее проводится трансформация гидрокортизона с помощью названной дегидрирующей культуры. Выделение готового продукта, преднизолона, осуществляется также путем экстракции-сепарации из культуральной жидкости, отличаясь лишь набором растворителей.

В настоящее время интенсивно разрабатываются методы использования мелкокристаллических стероидных субстратов. Микронизация субстрата до размеров частиц в несколько микрометров и внесение в ферментационную среду без растворителя позволяет повысить исходную концентрацию стероидного субстрата до 20 - 50 г/л.

Описан процесс, получивший название псевдокристаллферментации: дегидрирование измельченного порошка кортизона с помощью культуры Аgrоbасtеr sіtlіехв течение 5 дней. Получен кристаллический преднизолон с выходом 93%. Загрузку стероидного субстрата удается при этом довести до 500 г/л. Дегидрирование микрокристаллического гидрокортизона происходит по схеме:

гидрокортизон (кристаллы) - гидрокортизон (раствор) - преднизолон (раствор) -преднизолон (кристаллы)

В ходе реакции кристаллический гидрокортизон переходит в растворенное состояние и трансформируется внутри клеток в преднизолон, который, накапливаясь, кристаллизуется в виде игл. Отмечено также постоянное остаточное количество гидрокортизона при проведении «псевдокристаллферментации». Предполагают образование при этом «смешанных» кристаллов, состоящих из молекул гидрокортизона и преднизолона, соединенных в определенном соотношении (8:92) в осадок. Однако этот процесс до настоящого времени не получил широкого практического применения.

Одним из путей интенсификации процессов трансформации является предварительное индуцирование растущей культуры - трансформатора соответствующим субстратом или его аналогом. Этот прием связан с индуцированием биосинтеза соответствующих ферментных систем культуры и особенно широко применяется в процессах микробиологической дегидрогенизации.

Наиболее перспективным считается применение закрепленных (иммобилизованных) живых клеток микроорганизмов. Преимущества использования иммобилизованных клеток в технологии очевидно:

1. отсутствие затрат на выделение и очистку ферментов;

2. более высокая активность и стабильность по сравнению с иммобилизованными ферментами и свободными клетками;

3. уменьшение затрат на выделение и очистку продуктов реакции, ввил\ду их изолированности от биомассы и некоторых продуктов обмена;

4. появление возможности создания непрерывных автоматизированных процессов;

5. способность к длительному функционированию полиферментных систем и регенерации кофакторов.

Методы иммобилизации клеток:

1. адсорбция;

2. ковалентное и поперечное связывание;

3. метод включения в различные полимеры;

4. микрокапсулирование.

Метод включения, в частности, в целлюлозные волокна мембраны весьма технологичен и является перспективным для проведения одностадийных процессов. Одним из наиболее экономичных носителей для иммобилизации клеток является капля-каррагинан, полисахарид изприменяемых как пищевая добавкаморских красных водорослей Rоdорусеае, Gіnаtrіnасeаe. Интектные клетки, введенные в гель, интенсивно размножаются на питательной среде и могуг многократно использоваться как полиферментные системы.

Включение в альгинатные гели относится к мягким методам иммобилизации, т.е. клетки после иммобилизации остаются жизнеспособными и могут осуществлять полиферментные процессы. Положительными качествами геля являются возможность размножения в нем клеток, а также его способность к растворению при изменении рН и температуры, что позволяет выделять жизнеспособные клетки и облегчает изучение их физиологии и морфологии. Во многих случаях включение клеток в альминат приводит к лучшим результатам по сравнению с карратизаном. Преимущества иммобилизованных клеток делают их весьма перспективными. В частности, трансформации стероидных соединений. Именно стероиды были одними из первых субстратов, которые удалось трансформировать с помощью иммобилизованных клеток. В настоящее время достаточно досконально изучены процессы трансформации стероидных соединений живыми иммобилизованными клетками, исследованы пути направленного изменения ферментативной активности и ее стабилизации.

Контрольные вопросы

3. Какие химические модификации стероидной молекулы осуществляются с помощью биотрансформации?

4. Что служит основным источником сырья для производства стероидных препаратов и почему?

5. На чем основан выбор микроорганизмов, способных трансформировать стероиды?

Лекция 26