Объекты медицинской биотехнологии

Форма проведения лекции: обзорная лекция

 

План лекции

1. Методологические основы создания новых биотехнологических лекарственных средств.

2. Объекты медицинской биотехнологии.

 

1. Биотехнологический синтез биологически активных веществ продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, культур клеток и тканей, растений и животных - приобрел в последнее время большое значение и продолжает развиваться чрезвычайно быстрыми темпами.

Наряду с биосинтезом многие биологически активные вещества могут быть получены методами тонкого органического синтеза, поэтому выбор конкретного пути получения продукта определяется сравнительной экономической эффективностью биологического и химического способов производства. Часто на практике используют технологию, включающую и химические, и биологические стадии, которые взаимно дополняют друг друга. В результате промышленный биосинтез немыслим без применения (как на стадиях подготовки, так и при переработке продуктов) методов химической технологии, опробованных и нашедших широкое распространение в тонком органическом синтезе. В свою очередь последний все чаще не может обойтись без некоторых технологических стадий, осуществляемых с помощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов и ферментных систем.

Наглядное представление о выше сказанном может быть проиллюстрировано на примере технологии аминокислот. Все 20 представителей этого класса органических соединений, являющихся мономерами для построения природных полипептидов и белков, достаточно глубоко изучены в химическом смысле, а методы их синтеза описаны во всех учебниках органической химии.

Известно также, что, в частности, белки млекопитающих построены исключительно из одного типа аминокислот, так называемых левовращающих, обозначаемых буквой L.

Современными методами тонкого органического синтеза можно синтезировать D- и L-формы аминокислот в любых количествах, однако все реальные способы их производства приводят лишь к образованию рацематов.

Альтернативой химическому синтезу оказывается микробиологический процесс, в котором специально подобранные, отселекционированные, а иногда и сконструированные методами генетической инженерии штаммы-продуценты в процессе жизнедеятельности, обычно на поздних стадиях развития, осуществляют так называемый сверхсинтез аминокислот, то есть производят их в количествах, намного превышающих потребности самих клеток. Поэтому все аминокислоты, D-изомеры которых не приемлемы для употребления, получают в промышленном масштабе только биотехнологическими методами.

Необходимо отметить однако, что промышленный биосинтез аминокислот требует их выделения из весьма сложных по составу и разбавленных раствором - получающихся после отделения клеточной биомассы. Здесь и находит применение совокупность приемов, характерных для тонкого органического синтеза и предназначенных для получения товарных форм L-аминокислот, пригодных для кормового, пищевого или медицинского применения.

Похожая ситуация сложилась и в области производства антибиотиков. Несмотря на точное знание структуры практически всех известных веществ, обладающих антибиотическим действием, их чисто химический синтез громоздок и неэффективен. В промышленности получают антибиотики медицинского или ветеринарного назначения, используя способность соответствующих штаммов – продуцентов – генерировать данный антибиотик в определенной фазе роста и заданном режиме культивирования.

Однако за несколько десятилетий медицинского применения антибиотиков накопилось большое количество болезнетворных микроорганизмов, приобретших наследственную устойчивость к препаратам, ранее вызывавших их гибель. Выход из этой ситуации был достигнут путем химической трансформации природных антибиотиков: стали получать так называемые полусинтетические препараты, в структуру которых внесены некоторые изменения, не затрагивающие основной группировки атомов, ответственной за антибиотический эффект. Таким образом с помощью химических и биохимических (ферментативных) методов удается трансформировать природные пенициллины, цефалоспорины и т.п., опережая приспособление болезнетворных микроорганизмов к новым лекарственным препаратам.

Применение бактериальных препаратов, таких, как удобрения и средства защиты растений, также представляет собой альтернативу химическим веществам, используемым в земледелии. Однако здесь взаимоотношения биотехнологии и химической технологии оказываются иными. В отличие от минеральных удобрений и химических средств защиты растений, представляющих при неправильном или неумеренном потреблении очевидную опасность для окружающей среды, бакпрепараты значительно менее опасны, характеризуются более высокой избирательностью и, как правило, эффективностью действия. Таким образом, в данном вопросе речь идет о принципиально ином подходе к решению проблемы повышения урожайности сельскохозяйственных растений за счет применения биологических, а не химических методов обогащения почвы азотом и фосфором или устранения вредителей. В этом случае оказывается, что оптимальное сочетание биологических и химических средств позволяет добиться синергизма – усиления суммарного результата – и надежно избавить земледелие от целого ряда проблем.

Все сказанное иллюстрирует сложную систему взаимосвязи и конкуренции, установившуюся к настоящему времени между промышленной биотехнологией и химической технологией. Наиболее наглядное представление о современных биотехнологических методах получения биологически активных веществ дают изложенные в этом пособии основы получения технологии отдельных биопрепаратов.

В связи с широким использованием микроорганизмов – продуцентов разнообразных продуктов их жизнедеятельности – первоначальными следует назвать задачи получения их высокопродуктивных штаммов, обладающих ценными биосинтетическими свойствами. Эти задачи в тесном контакте с микробиологами решают генетики, а также специалисты, владеющие методами генетической инженерии.

С возникновением генной инженерии появилась возможность направленно создавать для промышленности микроорганизмы с заданными свойствами. Это значительно расширяет области практического использования микроорганизмов.

Промышленно важные продукты жизнедеятельности микроорганизмов по их природе и значению для самой микробной клетки делят на две основные группы:

2) первичные метаболиты (соединения, необходимые микроорганизмам для роста: аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды, витамины);

3) вторичные метаболиты (соединения, ненужные микроорганизмам для роста: антибиотики, токсины, алкалоиды, факторы роста растений).

Биологическую активность эти вещества проявляют различно: удовлетворяют потребности человека и животных, взаимодействуют с микроорганизмами, участвуют в разложении различных органических субстратов. Кроме того, некоторые аминокислоты могут служить сырьем для дальнейших превращений на основе химического синтеза.

Продукты микробного синтеза, чтобы стать объектом рентабельного промышленного производства, должны выделяться микробной клеткой в питательную среду и накапливаться в среде в количествах, которые оправдали бы сырьевые и энергетические затраты на культивирование микроорганизма и выделение продукта в необходимой для дальнейшего использования форме. В большинстве случаев выбор микробиологического способа получения того или иного вещества обусловлен полным отсутствием или весьма ограниченной возможностью получения его другими способами, в первую очередь - путем химического синтеза. Многие антибиотики, ферменты, биологически активные изомеры ряда аминокислот, пуриновые нуклеотиды, токсины, факторы роста растений в настоящее время возможно или, по крайней мере, гораздо проще получать с помощью микроорганизмов из доступного и дешевого сырья, чем осуществлять сложный, многоэтапный химический синтез или даже 1-2 этапа ферментативного синтеза, но на основе сложного и часто малодоступного сырья.

Однако природные штаммы микроорганизмов, как правило, не обладают способностью выделять и накапливать в питательной среде, т.е. продуцировать, такое количество нужного продукта, которое обеспечило бы достаточно низкую его стоимость и требуемый народному хозяйству или медицине объем производства. Природные штаммы некоторых групп микроорганизмов (несовершенные грибы, актиномицеты, бациллы) способны выделять в окружающую среду сравнительно небольшие количества антибиотиков, токсинов или гидролитических ферментов. Первичные метаболиты, как правило, микроорганизмами не выделяются в значительном количестве (синтезируемое количество этих веществ строго ограничено и рассчитано на потребности самой клетки). Исключение из этого правила – выделение глутаминовой кислоты природными штаммами (так называемой группы глутаматпродуцирующих коринебактерий) - не распространяется на подавляющее большинство других аминокислот.

В связи с этим задача селекционера – не только усиление природной способности микроорганизма продуцировать определенное вещество (антибиотик, фермент, токсин и др.), но во многих случаях и создание продуцента «заново» из штамма дикого типа, способного синтезировать вещество (например, аминокислоту), но не способного его продуцировать.

Дальнейшее повышение уровня продукции того или иного вещества у микроорганизма – это постоянная цель работы селекционеров, так как наиболее эффективный способ интенсификации микробиологического производства, не требующий дополнительных капиталовложений, заключается в использовании более продуктивного штамма.

Эти задачи осуществляются получением у природных штаммов наследственных изменений – мутаций, приводящих к усилению природной способности микроорганизма синтезировать и продуцировать определенное вещество, а также появлению новой способности – синтезировать вещество в избытке, сверх своих потребностей, и продуцировать его.

Все рассмотренные выше методы селекции продуцентов биологически активных веществ сегодня, в период интенсивного развития методов генной инженерии, называют традиционными. Эти методы в прошедшие 50 лет в огромной мере содействовали микробиологической промышленности антибиотиков, аминокислот, ферментов, витаминов и других практически важных веществ. Исчерпали ли традиционные методы свои возможности? Нам кажется, думать так преждевременно, как и надеяться на то, что генная инженерия в ближайшее время сможет быть применена для создания и улучшения обширного круга принадлежащих к разным таксономическим группам продуцентов, которыми располагает сейчас микробиологическая промышленность. Даже более реальная возможность использовать на основе генноинженерных методов в качестве продуцентов микроорганизмы, для которых эти методы наиболее отработаны, например Ecsherichia coli, едва ли удовлетворит промышленность числом продуктов микробного синтеза. В связи с этим очень важно для «старых» перспективных в промышленном отношении микроорганизмов, помимо совершенствования методов отбора нужного типа мутантов, развивать методы генетического обмена на основе слияния протопластов, трансдукций, трансформации хромосомной и плазмидной ДНК, которые расширяют возможности традиционных методов селекции.

Вместе с тем у промышленных микроорганизмов все шире проводится поиск плазмид и предпринимаются попытки их использования в качестве векторов при переносе генетического материала, его клонировании и амплификации. Эти исследования важны для понимания генетического контроля сложных процессов синтеза, таких, например, как синтез антибиотиков, для выявления «узких мест» в биосинтезе многих других продуктов. Одновременно они приближают промышленные микроорганизмы к объектам генной инженерии. Методология генной инженерии постоянно совершенствуется и расширяет свои возможности. В таком успешном встречном развитии разных методов и их «слиянии» на все большем числе продуцентов можно представить себе ближайшее будущее селекции микроорганизмов, призванной обеспечить промышленность высокопродуктивными штаммами.

В первой половине 70-х годов XX века развитие молекулярной биологии привело к возникновению новой экспериментальной техники, которая получила в СССР название «генной инженерии», а в западной литературе именуется «работой с рекомбинантными молекулами ДНК». Суть этой технологии заключается в фрагментировании молекул ДНК в строго определенных участках, воссоединении таких фрагментов, т.е. в создании новых рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Замечательным является то обстоятельство, что все матричные процессы основаны на узнавании ферментами клетки только участков начала и конца процесса. Для копирующих матрицу или работающих на матрицу ферментов последовательность нуклеотидов между сигналами начала и конца процесса безразлична. Ситуация, при которой в структурный ген внедрена дополнительная чужеродная ДНК, способная реплицировать, транскрибироваться и транслироваться в виде нового гибридного белка. Так как ДНК различных организмов однотипна, вышеописанная техника не имеет ограничений, связанных с видом и родом организма. Иными словами, сегодня возможен перенос генов любого организма в любой другой организм.

Перспективы применения генной инженерии для совершенствования штаммов микроорганизмов сегодня кажится почти неограниченными. Безусловно, будет развиваться такое направление, как создание штаммов – продуцентов белков человека, сельскохозяйственных животных и растений, что открывает огромные возможности не только для медицины и ветеринарии, но и пищевой промышленности. Камнем преткновения часто является не методология генной инженерии, а неполное знание биохимических путей синтеза того или иного соединения и недостаточная разработанность генетики многих промышленных штаммов. Именно поэтому до сих пор не создан указанным методом ни один штамм – продуцент антибиотиков, очень ограничено число штаммов – продуцентов первичных и вторичных метаболитов. Техника генной инженерии – это не только инструмент для практического «улучшения» штаммов, но и мощный способ познания механизмов биосинтеза и регуляции метаболизма микроорганизма. Дальнейшие успехи в конструировании высокопродуктивных штаммов микроорганизмов зависят от совместной работы микробиологов, генетиков, биохимиков и генных инженеров.

2. Биообъект – центральный и обязательный элемент биотехнологического производства, создающий его специфику.

Биообъектом может быть целостный сохранивший жизнеспособность многоклеточный или одноклеточный организм. Им могут являться изолированные клетки многоклеточного организма, а также вирусы и выделенные из клеток мультиферментные комплексы, включенные в определенный метаболический процесс. Наконец, биообъектом может быть индивидуальный изолированный фермент.

Функция биообъекта - полный биосинтез целевого продукта, включающий ряд последовательных ферментативных реакций или катализ лишь одной ферментативной реакции, которая имеет ключевое значение для получения целевого продукта.

Биообъект, осуществляющий полный биосинтез целевого продукта, называется продуцентом. Биообъект, являющийся индивидуальным ферментом или выполняющий функцию одной ферментативной реакции, используемой биотехнологом, называют промышленным катализатором.

Таким образом, к биообъектам относятся как макромолекулы, так и микро- и макроорганизмы.

В качестве макромолекул в промышленном производстве используются ферменты всех известных классов, но наиболее часто – гидролазы и трансферазы. Доказано, что использование ферментов в производстве в иммобилизованном виде, то есть связанных с нерастворимым носителем, наиболее рационально, так как в этом случае обеспечиваются многократность их применения и стандартность повторяющихся производственных циклов. С некоторой условностью «Лестница живых существ» начинается с вирусов. Последние в качестве биообъектов (с ослабленной патогенностью) используются прежде всего для приготовления вакцин.

Как биообъекты микробные клетки прокариот и эукариот в современном биотехнологическом производстве занимают доминирующее положение. Они являются продуцентами используемых в качестве лекарственных средств первичных метаболитов; аминокислот, азотистых оснований, коферментов, моно- и дисахаров, ферментов медицинского назначения, применяемых в заместительной терапии и т.д.

Микроорганизмы образуют огромное количество вторичных метаболитов, многие из которых нашли применение, например, антибиотики и другие корректоры гомеостаза клеток млекопитающих.

Пробиотики – препараты на основе биомассы отдельных видов микроорганизмов используются при дисбактериозах для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Микроорганизмы необходимы также при производстве вакцин. Наконец, микробные клетки методами генной инженерии могут быть превращены в продуценты видоспецифических для человека белковых гормонов, белковых факторов неспецифического иммунитета и т.д.

Высшие растения являются традиционным и к настоящему времени все еще наиболее обширным источником получения лекарственных средств. При использовании растений в качестве биообъектов основное внимание сосредоточено на вопросах культивирования растительной тканей на искусственных средах (каллусные и суспензионные культуры) и открывающихся при этом новых перспективах.

Традиционными поставщиками лекарственных и диагностических средств являются представители животного мира. Довольно часто в качестве биообъектов выступают млекопитающие, птицы, рептилии, амфибии, членистоногие, рыбы, моллюски. Разнообразие образуемых ими биологически активных соединений, нашедших применение в медицине, крайне велико.

В последние годы в связи с развитием технологии рекомбинантной ДНК стремительно возрастает важность такого биообъекта, как человек, хотя на первый взгляд, это кажется парадоксальным.

В принципе, человек уже давно мог быть отнесен к биообъектам, например, при получении гомологичной антисыворотки или в случае использования тканей и органов человека для их пересадки, например, костного мозга, почек и т.д.

Однако биообъектом с позиций биотехнологии (при использовании биореакторов) человек стал лишь после реализации возможности клонирования его ДНК (точнее его экзонов) в клетках микроорганизмов. За счет такого подхода был ликвидирован дефицит сырья для получения видоспецифических белков человека.

Характер биологической системы (микроорганизмы, клеточные линии насекомых, растений и млекопитающих, многоклеточные организмы) исключительно важен для биотехнологического процесса. Во многих случаях именно генетически модифицированная самовоспроизводящаяся биологическая единица (микроорганизм, вирус, растение или животное) является конечным коммерческим продуктом.

Прокариоты и эукариоты. Все живые организмы принято делить на две основные группы: прокариоты и эукариоты. Приблизительно 1,5 млрд лет назад произошел переход от маленьких клеток со сравнительно простой внутренней структурой (так называемых прокариот, к которым относятся различные бактерии) к большим по размеру и значительно более сложно устроенным эукариотическим клеткам, подобным клеткам высших растений и животных.

Основные структурные различия прокариот и эукариот:

· наличие или отсутствие ядра, содержащего хромосомную ДНК;

· строение и химический состав клеточной стенки;

· наличие или отсутствие субклеточных цитоплазматических органелл.

В прокариотической бактериальной клетке хромосомная ДНК находится непосредственно в цитоплазме, клетка окружена ригидной клеточной стенкой. В клетке нет субклеточных цитоплазматических органелл. В оптимальных условиях прокариотическая клетка может делиться каждые 20 минут и таким образом давать жизнь более 10 млрд клеток менее чем за сутки.

В эукариотической клетке имеется ядро, отделенное от цитоплазмы ядерной мембраной, хромосомная ДНК находится в ядре. В цитоплазме содержатся различные субклеточные органеллы: мембраны, окружающие ядро, митохондрии, образующие лабиринт эндоплазматического ретикулума (ЭПР), где синтезируются липиды и мембранные белки. Мембраны формируют стопки утолщенных пузырьков, составляющих аппарат Гольджи, который участвует в синтезе и транспорте различных органических молекул. Мембраны окружают лизосомы (субклеточные структуры диаметром 0,2-0,5 мкм), содержащие гидролитические ферменты, необходимые для внутриклеточного пищеварения.

Мембраны, таким образом, защищают от действия этих ферментов белки и нуклеиновые кислоты самой клетки. Мембраны также окружают пероксисомы, содержащие окислительные ферменты, производящие и разрушающие опасные высокореакционоспособные перекиси (пероксиды). Обмен между внутриклеточными, окруженными мембранами структурами и внеклеточной средой происходит с помощью эндоцитоза.

Различают две группы бактерий – эубактерии, населяющие почву, воду и другие организмы, и архебактерии, встречающиеся в таких средах обитания, как болота, океанские глубины, очень соленые воды и горячие кислые источники. Исходя из температурного режима, который предпочитают те или иные микроорганизмы, их подразделяют на термофилы (от 45 до 90 ^оС и выше), мезофилы (от 10 до 47 ^оС) и психрофилы или психротрофы (от -5 до 35 ^оС). Микроорганизмы, активно размножающиеся лишь в определенном диапазоне температур, - полезный инструмент для решения различных биотехнологических задач. Например, термофилы часто служат источником генов, кодирующих термостабильные ферменты, а генетически видоизмененные психротрофы используются при пониженной температуре для биодеградации токсичных отходов, содержащихся в почве и воде.

Среди множества биологических объектов, использующихся в молекулярной биотехнологии, основными «рабочими лошадками» являются бактерии Escherichia coli, одноклеточные дрожжи Sacharomyces cerevisiae и различные клеточные линии животного происхождения. Все они играют важную роль в получении белков, кодируемых клонированными генами.

E.coli – грамотрицательная непатогенная подвижная палочка длиной менее 1 мкм. Традиционная среда ее обитания – кишечник человека, может также высеваться из почвы и воды. Штаммы E.coli культивируются на обогащенных жидких питательных средах, содержащих аминокислоты, витамины, соли, микроэлементы и источник углерода. E.coli можно культивировать в аэробных и анаэробных условиях, но для оптимальной продукции рекомбинантных белков E.coli и другие микроорганизмы обычно выращивают в аэробных условиях. Рост клеточной массы и продукция белка лимитируются содержанием в питательной среде растворенного кислорода, для этого в ферментах создают условия аэрации.

Кроме E.coli в молекулярной биотехнологии используют множество других микроорганизмов, которые подразделяют на две группы:

- микроорганизмы как источники специфических генов (например, ген, кодирующий стабильную ДНК-полимеразу, которая используется в широкоприменяемой полимеразной цепной реакции – ПЦР; этот ген был выделен из термофильных бактерий и клонирован в Е.соli).

- микроорганизмы, созданные генноинженерными методами для решения определенных задач (например, различные штаммы Corynebacterium glutamicum, генетически модифицированные с целью повышения продукции промышленно важных аминокислот).

Saccharomyces cerevisiae – непатогенные одноклеточные организмы с диаметром клетки около 5 мкм, во многих отношениях представляют эукариотичес кий аналог E.coli S. cerevisiae размножаются почкованием, их способность к превращению сахара в этанол и углекислый газ издавна использовалась для изготовления напитков и хлеба. Клетки дрожжей делятся каждые 1,5-2 ч Saccharomyces cerevisiae является удобной моделью для исследования других эукариот, в том числе человека, так как многие гены, ответственные за регуляцию клеточного деления S.cerevisiae, сходны с таковыми у человека. Это способствовало идентификации и характеристике генов человека, отвечающих за развитие новообразований. Генетическая система дрожжей является непременным участником всех исследований по изучению ДНК человека.

Синтезированный бактериальной клеткой эукариотический белок часто подвергают ферментативной модификации, присоединяя к белковой молекуле низкомолекулярные соединения, что необходимо для правильного функционирования белка. Однако E.coli и другие прокариоты не способны осуществлять эту модификацию, поэтому для получения полноценных эукариотических белков используют S.cerevisiae и другие виды дрожжей.

В качестве биологических систем в молекулярной биотехнологии используют культуру эукариотических клеток. Кусочек ткани определенного организма (насекомого, растения, млекопитающего) обрабатывают протеолитическими ферментами (трипсином), расщепляющими белки межклеточного материала, при работе с растительными клетками используют ферменты, разрушающие клеточную стенку. Высвободившиеся клетки помещают в питательную среду, содержащую аминокислоты, антибиотики, витамины, соли, глюкозу, факторы роста. В этих условиях (деление клеток млекопитающих происходит примерно раз в сутки) на стенке емкости с культурой образуется клеточный монослой. Если после этого не перенести клетки в емкости со свежей питательной средой, рост прекращается. Обычно удается переносить (перевивать, субкультивировать) и поддерживать до 50-100 клеточных генераций исходной (первичной) клеточной культуры, затем клетки начинают терять способность к делению и гибнут.

В молекулярной биотехнологии устойчивые линии используют для крупномасштабного производства вакцин и рекомбинантных белков, для размножения вирусов и выявления белков, которые кодируются клонированными последовательностями ДНК.

 

Контрольные вопросы

 

1. Особенности биообъектов

2. Требования к биообъектам

3. Основные биообъекты, применяемые в молекулярной биотехнологии

4. Перечислите основные задачи медицинской биотехнологии.

5. Важен ли характер биологической системы для биотехнологического процесса?

6. Наиболее часто применяемые бактерии в методах генной инженерии.

7. Этапы развития медицинской биотехнологии.

 

Лекция 3