Питательные среды, состав, стерилизация

Форма проведения лекции: лекция-консультация

План лекции

1. Состав питательной среды.

2. Стерилизация питательных сред.

 

1. В микробиологической практике для выращивания микроорганиз­мов используют разнообразные питательные среды, которые по составу подразделяют на естественные или натуральные полусинтетические и синтетические среды.

Питательные среды бывают:

- синтетические - они составляются строго по регламенту только из чистых органических и неорганических веществ, то есть их состав полностью известен, применяют только в лабораториях;

- природные среды - составляются из любых отходов и полупродуктов, получаются более дешевые среды, которые применяются в промышленности;

- полусинтетические среды - смесь первых и вторых.

Натуральные среды состоят из продуктов животного и расти­тельного происхождения - мяса, молока, картофеля, моркови и т. д.

Примерами натуральных сред являются:

- мясо-пептонный бульон, состоящий из экстракта мяса (500 г мяса на 1 л воды), 0,5% NaCl и 1% пептона (продуктов неполного раз­ложения белка);

- неохмеленное пивное сусло, приготовляемое на основе солода (про­росших зерен ячменя), гидролизованного до cахаров;

- дрожжевая среда, состоящая из экстракта дрожжей (7-10 г сухих дрожжей на 1 л воды), к которому добавляют углеводы (1-2%), ми­неральные соли К₂НРО4 (0,1%) и NаСl (0,5%);

- картофельная среда, которая готовится путем отвара картофеля (200 г картофеля на 1 л воды) и др.

На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорга­низмы, так как в таких средах имеются, как правило, все компоненты, необходимые для их роста.

Полусинтетические среды в своем составе наряду с соединения­ми известной химической природы содержат вещества неопределенного состава.

К полусинтетическим средам относят мясо-пептонный бульон с глюкозой и фосфорнокислым калием, картофельную среду с глюкозой и пептоном, а также среды известного состава с добавкой различных фак­торов роста (гидролизата казеина, дрожжевого автолизата, кукурузного экстракта и т. д.).

Синтетические среды - это среды, в состав которых входят из­вестные химические соединения в определенных концентрациях.

Например, состав среды Чапека для культивирования грибов сле­дующий: глюкоза - 30 г; азотнокислый натрий - 2 г; фосфорнокислый (однозамещенный) калий - 1 г; сернокислый магний - 0,5 г; хлористый, калий 0,5 г; сернокислое железо - 0,01 г; вода - 1000 мл.

По назначению различают элективные и дифференциально-диагно­стические (индикаторные) среды.

Элективные среды обеспечивают преимущественное развитие одного вида или группы микроорганизмов и менее пригодны (или со­всем непригодны) для развития других.

Дифференциально-диагностические (индикаторные) среды по­зволяют достаточно быстро отличить одни виды микроорганизмов от других. Состав этих сред подбирают с таким расчетом, чтобы он позво­лил четко выявить наиболее характерные свойства определенного вида.

По физическому состоянию различают жидкие, плотные и сыпу­чие среды.

Жидкие среды применяют для выяснения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы или продуктов метаболизма, а также поддержания и хранения многих микроорганизмов, плохо развивающихся на плотных средах.

Сыпучие среды применяют в промышленной микробиологии. К ним относятся, например, разваренное пшено, отруби, кварцевый песок, пропитанные питательным раствором.

Плотные среды используют для выделения чистых культур (полу­чение изолированных колоний), диагностических целей (установление морфологии колоний, особенностей роста на скошенном агаре и др.), для хранения культур, количественного учета микроорганизмов, опре­деления их антагонистических свойств и в ряде других случаев.

Уплотнение сред осуществляют с помощью агар-агара, желатины и кремнекислого геля (силикагеля).

Наиболее часто в микробиологической практике для уплотнения сред используется агар-агар. Это сложный полисахарид, получаемый из морских водорослей. Большинство микроорганизмов не используют его в качестве питательного субстрата.

В воде агар-агар образует гели, плавящиеся при 100° С, затверде­вающие при температуре около 40° С. Чаще всего агар-агар добавляют к средам в количестве 1,5-2%. Среду с внесенным в нее агаром нагревают на кипящей водяной бане до полного расплавления агара.

Менее широко используется желатина - белок, получаемый при вываривании костей и хрящей животных. Желатину добавляют к жид­ким средам в количестве 10-15%. Образуемый желатиновый гель пла­вится при 23-26° С.

При специальных исследованиях используется кремнекислый гель (силикагель) - вещество неорганической природы и его используют как твердую основу для синтетических сред.

К сырью для биотехнологических производств предъявляют ряд требований:

- оно должно обеспечивать образование требуемого продукта;

- среда должна быть доступной (для дешевых продуктов, а для очень дорогих можно применять дорогие среды);

- питательная среда должна обеспечить легкое выделение продукта;

- среда должна быть не токсичной и не загрязнять окружающую среду.

Биотехнологическая продукция составляет миллионы тонн в год, поэтому сырья нужно много. 90 % сырья расходуется на производство спирта, а остальные 10 % - на все биотехнологические производства. Микроорганизм может использовать для жизни любое органическое соединение, поэтому весь мировой запас органики (растения, почва, химикаты) потенциально является пищей для микроорганизмов.

Однако для того, чтобы продуцент производил нужный продукт, ему необходимо индивидуальное питательное соединение (питательная среда).

Питательная среда является сложной трёхфазной системой и как бы продолжением микробной клетки.

Кроме индивидуальных органических соединений, в промышленности используют различные отходы. Например: 1 тонна кукурузного крахмала стоит 64-91 $, меласса - 140 $, этанол- 430 $, глюкоза- 290 $, сахароза- 629 $.

Всё сырьё можно разделить на несколько групп.

- углеродсодержащее сырьё – глюкоза, сахароза, лактоза, крахмал, спирты, органические кислоты и т. д.

Глюкоза - С₆H₁₂O₆ кристаллическая, может содержать воды не более 9 %, золы - не более 0,07 %, (в том числе не более 0,004 % железа). В сухом веществе должно быть не менее 99,5 % редуцирующих веществ.

Сахароза - (свекловичный сахар, тростниковый сахар) С₁₂H₂₂O₁₁ техническая содержит не менее 99,75 % сахарозы, не более 0,003 % золы. Влажность до 0,15 %.

Лактоза – (молочный сахар) С₁₂H₂₂O₁₁, получаемая из молочной сыворотки, является отходом при изготовлении масла и сыра. После сгущения до концентрации сахаров 50 % и кристаллизации получают концентрат лактозы.

Лактозный сахар – сырец содержит не менее 92 % сахара, не более 3 % воды, 2 % золы и 1 % молочной кислоты. Количество белка не регламентировано, но обычно оно не превышает 3 %.

Крахмал представляет собой смесь полисахаридов, встречающихся в растениях в виде зерен (запасной углевод растений). Получают в промышленном масштабе из картофеля и кукурузы. Под действием ферментов микроорганизмов крахмал гидролизуется до глюкозы. В зависимости от сорта (высший, I, II, III) содержание золы в крахмале достигает 0,35 - 1,2 %.

Метиловый спирт (метанол) CH₃OH представляет собой бесцветную, легкоподвижную жидкость, по запаху напоминающую этиловый спирт. Хорошо растворяется в воде, легко усваивается многими микроорганизмами. Метиловый спирт может быть получен из природного газа, нефти, каменного угля. Перспектива использования метилового спирта во многом зависит от эффективности способа его получения.

Следует помнить, что метиловый спирт - сильный яд для человека. Приём внутрь 30 мл метилового спирта смертелен.

Этиловый спирт (этанол) С₂H₅OH является перспективным сырьём для выращивания микроорганизмов. Этиловый спирт хорошо смешивается с водой, нетоксичен, получаемая на нём биомасса не требует специальной очистки. В качестве источника углерода могут использоваться все марки этилового спирта, получаемого как микробиологическим, так и химическим путём. В этиловом спирте допускается присутствие незначительных количеств изопропилового спирта, серусодержащих соединений, органических кислот, сложных эфиров, диэтилового эфира, нерастворимых в воде веществ.

Уксусная кислота CH₃COOH с содержанием основного вещества не менее 60 %, а формальдегида HCHO и муравьиной кислоты HCOOH - не более 1 % может быть использована в качестве источника углерода.

К этой же группе относятся различные отходы и побочные продукты: меласса, зерновая и картофельная барда, кукурузная мука, мелассная барда, ацетонобутиловая барда.

Меласса - побочный нестандартный продукт сахарной промышленности, который остаётся после второго отделения кристаллов сахара. Цвет – тёмно – коричневый, плотность 1,35 - 1,40 г/см³. Меласса содержит 61- 68 % сухих веществ, 40 - 55 % сахарозы. Кроме того, в ней имеется 0,5 - 2,0 % инвертного сахара и 0,5 - 2,5 % раффинозы. В мелассе содержится 1,1 - 1,5 % азота, причем третья часть его находится в форме бетаина, использовать который микроорганизмы не могут. В состав мелассы входят многие аминокислоты (аспарагиновая, глутаминовая, лейцин, изолейцин, тирозин) и витамины группы В (биотин, рибофлавин, инозит, никотиновая и пантотеновая кислоты). Особенно большое значение имеет биотин (его содержание - 80 мг/т).

В мелассной золе много калия (30 - 40 %), магния (1,5 - 4,5 %), кальция (до 14 %), железа и других элементов, но сравнительно мало фосфора. При хранении мелассы могут иметь место потери сахара в результате деятельности микроорганизмов.

Кукурузная мука. Состав кукурузной муки может колебаться в значительных пределах в зависимости от сорта кукурузы, условии её выращивания и хранения. В среднем она содержит 67 - 70 % крахмала, около 10 % других углеводов (клетчатки, пентозанов, декстринов, растворимых углеводов), около 12 % белков (30 % глютелина и 45 - 50 % казеина). Влажность не должна превышать 15 %. Содержание золы примерно 0,9 %. Зола кукурузной муки содержит до 45 % фосфорного ангидрида, 30 % оксида калия и 15 % оксида магния. Кукурузная мука служит источником углерода в питательных средах для биосинтеза антибиотиков и ферментов. Она является самым дешевым продуктом из всех зерновых, и её цена зависит от степени измельчения.

Мелассная барда является нестандартным продуктом, отходом спиртового производства. Содержание сухих веществ в натуральной барде 6 - 10 %. В составе барды кроме дрожжевой массы присутствуют аминокислоты, гликолевая, молочная, янтарная кислоты, соли кальция, калия, натрия, марганца, кобальта, меди и ряд витаминов группы В.

Ацетонобутиловая барда - нестандартный продукт, являющийся отходом микробиологического производства органических растворителей - ацетона и бутилового спирта. Для микробиологического синтеза используют барду после отделения шлама. В составе барды имеются углеводы, клетчатка, азотсодержащие и зольные вещества.

- углеводородсодержащие сырье - это парафины нефти, метан (сырьё дешевое, и имеет постоянный состав, что очень хорошо для автоматизации процессов).

- к нетрадиционным источникам сырьяотносится метанол, этанол и т. д.

Эти три группы – основной компонент питательной среды то есть углеродсодержащий. Кроме этого в состав питательной среды должны входить:

- источники минерального питания (соли фосфора, азота, натрия, калия, магния, кальция и т. д. содержащие АТФ);

- микроэлементы (цинк, марганец, молибден, кобальт, сера и т. д.);

- комплексные обогатители сред. Они содержат биологически активные вещества (БАВ) – витамины, гормоны, ферменты, факторы роста.

Эти вещества вводят не в чистом виде, а в составе каких-то природных смесей, например: кукурузный экстракт, экстракт солодовых ростков, дрожжевой автолизат и т. д.

Основной принцип составления питательной среды - это удовлетворение физических потребностей микроорганизмов.

Каждый конкретный микробиологический процесс имеет свои особенности на стадии приготовления питательных сред, и это связано с применяемым в данном производстве источником углерода.

Растворимые источники углерода (например, сахара) предварительно растворяют в воде, доводя растворы до определенной концентрации в небольших открытых реакторах с мешалками, а затем подают в закрытый реактор – смеситель с плоским дном, снабженный для ввода пара барботажным устройством.

Нерастворимые источники углерода тщательно суспендируют в воде в реакторе с мешалкой и переводят в суспензию в реакторе - смесителе. Крахмалосодержащее сырьё предварительно клейстеризуют.

Минеральные соли растворяют в реакторе с мешалкой, а перед подачей в реактор - смеситель фильтруют для удаления шлама (гипс и другие нерастворимые осадки). Раствор микроэлементов обычно готовится отдельно.

В реакторе - смесителе все поданные в необходимых количествах компоненты тщательно перемешиваются, рН среды доводится до необходимого значения подачей аммиачной воды или кислоты. Реакторы для приготовления питательной среды должны быть снабжены достаточно мощными мешалками, а также перегородками - отражателями, не допускающими завихрения и вращения жидкости. В зависимости от состава используемой питательной среды выбирают тип перемешивающего устройства как в аппаратах для подготовки различных источников углерода (растворение сахаров, разбавление мелассы, клейстеризация крахмала и т. п.), так и в самом реакторе - смесителе для приготовления питательной среды.

2. Стерилизация - один из важных и необходимых приемов в мик­робиологической технике. Слово «стерилизация» в переводе с латин­ского (sterilis) означает обеспложивание. В микробиологии под стерили­зацией понимают гибель всех живых микроорганизмов. В микробиоло­гической практике стерилизуют питательные среды, посуду, инстру­менты и другие необходимые материалы, чтобы не допустить развития посторонней микрофлоры.

Стерилизация питательных сред и посуды - обязательный момент в работе при выполнении всех задач практикума.

Существуют различные методы стерилизации: физический, меха­нический и химический. Целесообразность применения каждого из них определяется особенностями материала, подлежащего стерилизации, его физическими свойствами, химическим составом, целью исследования.

Приготовленная в реакторе - смесителе питательная среда должна быть подвергнута стерилизации. Для стерилизации питательных сред используют два метода: при периодическом культивировании - циклический и при непрерывном культивировании - непрерывный.

Циклический метод стерилизации питательной среды очень прост. Это операцию можно осуществлять непосредственно в ферментере. При этом среда и оборудование стерилизуются одновременно. Чаще всего используют комбинированный нагрев острым и глухим паром. Острый пар подают в питательную среду, а глухой - в рубашку (или змеевик). Острый пар поступает в ферментер через штуцеры для подачи посевного материала, воздуха и для взятия проб. Поэтому вся арматура, соединенная с ферментером, стерилизуется проходящим острым паром.

Так как обработка питательной среды острым паром приводит к образованию конденсата, необходимо заранее учитывать разбавление среды конденсатом и вносить соответствующую поправку в рецептуру приготавливаемой среды. Тогда к концу стерилизации среда будет иметь необходимую концентрацию всех питательных компонентов.

При циклической стерилизации поддерживают температуру 121^оС, что соответствует давлению насыщенного пара 100 кПА. Обычно питательные среды выдерживают при такой температуре от 30 - 40 мин. Полный цикл нагревания, выдержки и охлаждения для ферментеров большого объёма достигает нескольких часов.

Длительная тепловая стерилизация приводит к определенным химическим изменениям в составе питательной среды. Некоторые нестойкие к нагреванию соединения разлагаются, что приводит к потере необходимых для микроорганизмов питательных веществ. Другие соединения могут вступать во взаимодействие между собой с образованием продуктов, ингибирующих рост микроорганизмов. Большинство изменений химических компонентов в составе питательной среды может происходить при температурах, более высоких, чем температура стерилизации. Следовательно, эффективная стерилизация при минимальном изменении состава среды может быть достигнута применением более высокой температуры, быстрым нагреванием и охлаждением среды. Поэтому в настоящее время циклический метод применяют для стерилизации среды только в аппаратах малого объёма.

Метод высокотемпературной непрерывной стерилизации, используемый на большинстве заводов, дает возможность свести к минимуму ухудшение питательных качеств среды без снижения эффективности самой стерилизации.

При непрерывной стерилизации можно значительно сократить время стерилизации, а, следовательно, снизить расход пара. Кроме того, этот вид стерилизации легко поддается автоматизации.

Для непрерывной стерилизации приготовленная в отдельной емкости питательная среда насосом прокачивается через установку в простерилизованный ферментер.

Применение более высоких температур позволяет резко сократить продолжительность выдерживания среды при максимальной температуре, а периоды нагревания и охлаждения осуществить за несколько секунд.

Если питательная среда не содержит суспендированных частиц, то температура 150 - 160^оС обеспечивает мгновенную стерилизацию. При наличии твердых суспендированных частиц в среде оптимальная для стерилизации температура должна быть ниже, так как требует более длительное время для прогревания таких частиц. В данном случае температура стерилизации составляет 135^оС, а длительность выдержки - от 5 до 15 минут.

 

Контрольные вопросы

 

1.Общая характеристика сырья для биотехнологических производств.

2. Приготовление и стерилизация питательных сред.

3. Основные требования и ограничения к сырью.

4. Основные компоненты питательной среды.

5. Периодическая или циклическая стерилизация.

6. Непрерывная стерилизация

7. Принципы конструирования питательных сред

8. Основные виды сырья и их сравнительная характеристика

 

Лекция 10