Изучение цитотоксичности наноматериалов для клеток линии А549 с помощью окраски метиленовым синим

 

Клетки линии А549 высевали в 24-луночные планшеты, куда вносили НЧ серебра. Для оценки жизнеспособности клеток использовали 0,4 % раствор метиленового синего. Окрашивание проводили через 8 и 24 ч после внесения наночастиц. Подсчет числа клеток проводили в 5 произвольных полях зрения, рассчитывали среднее значение Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Влияние НЧ серебра в различных концентрациях на жизнеспособность клеток линии А549

Вариант опыта	Число клеток
8 ч	24 ч.
Общее число клеток	Число окрашенных клеток	% гибель	Общее число клеток	Число окрашенных клеток	% гибель
НЧ серебра, 100 мкг/мл	67,2	4,6	6,8	88,4	5,6	6,3
НЧ серебра, 300 мкг/мл			37,3	42,2	32,6	77,2

 

Показано, что при увеличении времени воздействия эффект наночастиц серебра на клетки возрастает.

Можно сделать вывод о применимости метода окраски клеток в культуре метиленовым синим для определения цитотоксического действия НЧ путем оценки целостности мембран клеток.

 

Изучение жизнеспособности клеток в культуре по активности лактатдегидрогеназы в среде культивирования

Изучена активность лактатдегидрогеназы (далее - ЛДГ) в среде культивирования клеток А549 при добавлении НЧ серебра в концентрациях от 100 до 1000 мкг/мл, экспозиция составила 24 ч (таблицы 3).

 

Таблица 3 – Результаты изучения влияния НЧ серебра на активность ЛДГ в среде культивирования клеток линии А549

Концентрация НЧ, мкг/мл	Активность ЛДГ, мЕ/мл

 

В результате активность ЛДГ при максимальных концентрациях наноматериала возрастала в 1,5 раза.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наиболее перспективными объектами для изучения являются наночастицы серебра т.к установлено, что наночастицы серебра являются одним из наиболее перспективных типов наночастиц металлов. По меньшей мере, 235 видов товаров народного потребления, включая зубную пасту, перевязочные материалы, средства для депиляции, содержат наносеребро. Вероятно, наночастицы серебра найдут широкое применение в производстве текстиля, косметических средств, антисептиков, полимеров, лакокрасочных материалов.. Их производство и сфера применения увеличиваются, что может привести к негативному воздействию на здоровье человека и окружающую среду.

В MTT тесте среднесмертельная концентрация наночастиц серебра для клеток линии А549 и сублинии FL практически совпала и составила 1,3 и 1 мг/мл соответственно, что на порядок выше, чем среднесмертельная концентрация для лимфоцитов человека. В эксперименте на кардиомиоцитах крысы LC50 наночастиц серебра определена на уровне 8 мкг/мл.

В эксперименте на клетках линии А549 оценивали пригодность окраски трипановым синим для определения числа погибших (с нарушенной проницаемостью мембраны) клеток. Число погибших клеток, определенное по числу окрашенных клеток, оказалось несколько завышенным по сравнению с результатами подсчета разницы между живыми клетками в контроле и в опыте после смывания округлившихся и открепленных клеток. Можно сделать вывод о применимости метода окраски клеток в культуре метиленовым синим для определения цитотоксического действия НЧ путем оценки целостности мембран клеток.

При изучении влияния наноматериалов на целостность мембраны клеток установлено, что активность ЛДГ при максимальных концентрациях наноматериалов возрастала в 1,5 раза.

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

 

1 KemI (2008) Nanotechnology – high risk with small particles? / KemI Report 6/07. – Swedish Chemicals Agency, 2008. – 74 p.

2 Toxic potential of materials at the nanolevel / A. Nel [at al.] // Science. – 2006. – N 5761, Vol. 311. – P. 622 – 627.

3 Webster, T.J. Nanotechnology for the regeneration of hard and soft tissues / T.J. Webster. - Singapore, 2007. – P. 207-214.

4 Air pollution, oxidative stress and dietary supplementation: A review / I. Romieu [et al.] // European respiratory journal. – 2008. – Vol. 31. – P. 179-197

5 Pulmonary applications and toxicity of engineered nanoparticles / J. Card [et al.] // Aamerican journal of physiology and lung cell molecular physiology. – 2008. – Vol. 295. – P. 400-411.

6 Long-term air pollution exposure is associated with neuroinflammation, an altered innate immune response, disruption of the blood-brain barrier, ultrafine particulate deposition, and accumulation of amyloid β-42 and α-synuclein in children and young adults / L. Calderón-Garcidueñas [et al.] // Toxicologic pathology. – 2008. – Vol. 36. – P. 289-310.

7 Seaton, A. Nanotechnology and the occupational physician / A. Seaton // Occupational medicine. – 2006. – Vol. 56, N 5. – P. 312–316.

8 The toxicity of diesel exhaust: implications for primary care / I. Krivoshto [et al.] // Journal of the American board of family medicine. – 2008. – Vol. 21, N1. – P. 55-62.

9 Assessing toxicity of fine and nanoparticles: comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles / C.M. Sayes [et al.] // Toxicological sciences. – 2007. – Vol. 97, N1. – P. 163-180.

10 Dreher, K.L. Health and environmental impact of nanotechnology: toxicological assessment of manufactured nanoparticles / K.L. Dreher // Toxicological sciences. – 2004. – Vol. 77. – P. 3-5.

11 Meng, H. A predictive toxicological paradigm for the safety assessment of nanomaterials / H. Meng et al. // ACS. – 2009. – Vol. 3, N 7. – P. 1620-1627.

12 Riss, T.L., Moravec, R.A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays / T.L. Riss, R.A. Moravec // Assay Drug Dev. Technol. – Vol. 2, N 1. – P. 51–62.

13 Decker, T., Lohmann-Matthes, M.L. A quick and simple method for the quantitation of lactate dehydrogenase release in measurements of cellular cytotoxicity and tumor necrosis factor (TNF) activity / T. Decker, M.L. Lohmann-Matthes // J. Immunol. Methods. – Vol. 115, N 1. – P. 61–69.

14 Культура животных клеток. Методы: пер. с англ. / под ред. Р. Фрешни. – М.: Мир, 1989. – 333 с.

15 Комплексная биологическая оценка объектов природного и искусственного происхождения на Tetrahymena pyriformis: метод. рекомендации / разраб.: Белорус. науч.-иссл. сан.-гиг. ин-т; авт.-сост. А.С. Богдан. – Минск, 1996. – 19 с.

16 Maron, D.M. Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test / D.M. Maron, B.N. Ames // Mutat. Res. – 1983. – Vol. 113, N 3-4. – P. 173–215.

17 OECD Guideline 471, Bacterial Reverse Mutation Test, updated and adopted July 21, 1997.

18 Фонштейн, Л.М. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем: Методические указания / Л.М. Фонштейн [и др.]. – М., 1985. – 34 с.

19 Гузев, B.C., Левин, C.B. Техногенные изменения сообщества почвенных микроорганизмов / B.C. Гузев, C.B. Левин // Тез. докл. конф. «Перспективы развития почвенной биологии». – Москва, 2001. – С. 178-219.

20 Наплекова, H.H. Микробная индикация состояния почв / Н.Н. Наплекова // Тез. докл. конф. «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе». – Иркутск, 2002. – С. 160-161.