Иисследование цитотоксичности наночастиц

 

Реализация токсичности наноматериалов обеспечивается следующими свойствами: физическое сродство к биологическим структурам, например посредством электростатического или гидрофобного взаимодействия; каталитическиие свойства, с активацией окислительно-восстановительных реакций, например индукция молекул кислорода и воды с образованием АФК; распад наночастиц с образованием токсичных соединений

К основным проблемам токсичности наноматериалов можно отнести следующие. Во-первых токсичность наночастиц не может быть производной токсичности аналогов в макродисперсной фазе или в форме сплошной фазы, а во-вторых, имеющиеся токсикологические методологии основаны на определении токсичности вещества относительно массовой концентрации, что не приемлемо для наноматериалов, для которых определяющим свойством может быть площадь поверхности или число наночастиц.

Недавние инновации в науке и технике позволили разработать ряд тестов in vitro, позволяющих прогнозировать токсичность для животных. Поскольку требования для тестирования нанматериалов еще законодательно не установлены, ученые имеют возможность осуществлять поиск методов, основанных на новейших достижениях науки и применять их на практике.

Многие модели in vitro превосходят методы изучения токсичности, основанные на использовании животных, которые традиционно применялись в области токсикологии. Модели с использованием животных не только негуманны, но и часто недостаточно надежны с точки зрения прогнозирования эффектов у человека. Область нанотоксикологии обязана включить доступную технологию. Далее представлены наиболее многообещающие методы in vitro, доступные в настоящее время для проведения оценки безопасности наноматериалов.

Для изучения действия наноматериалов на типы клеток, соответствующие «входным воротам», применяется ряд методов, позволяющих определить цитотоксичность, способность наноматериалов вызывать воспаление, окислительный стресс, а также генотоксичность.

Токсические эффекты НЧ связывают, в первую очередь, с формированием окислительного стресса и накоплением свободнорадикальных продуктов [17].

Методы in vitro на культурах клеток позволяют изучить: окислительный стресс и АОЗ, воспаление, жизнеспособность клеток, пролиферацию, апоптоз, некроз, нарушение функции митохондрий, влияние на мембраны, клеточную локализацию наночастиц.

Тесты на цитотоксичность традиционно используют в фармацевтической промышленности для скрининга биологически активных соединений. В настоящее время их широко применяют для оценки наноматериалов. Существует множество способов оценки цитотоксического действия. Один из них – определение числа живых и погибших клеток.

Оценка целостности клеточной мембраны является одним из наиболее распространенных способов измерить жизнеспособность клетки и цитотоксические эффекты. Соединения, обладающие цитотоксичностью, часто вызывают нарушение целостности клеточной мембраны, что можно установить с помощью витального окрашивания трипановым синим или йодидом пропидия, которые свободно проникают через поврежденную мембрану и окрашивают внутриклеточные компоненты, но в здоровых клетках отсутствуют [18]. Целостность мембран может быть оценена другим способом - путем определения лактатдегидрогеназы, имеющей в норме внутриклеточную локализацию, во внешней среде [19]. Цитотоксичность может также быть определена с использованием MTT теста, основанного на способности митохондриальных дегидрогеназ конвертировать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в формазан. Подобный тест, основанный на окислительно-восстановительном потенциале, был разработан с применением флуоресцентного красителя – диазорезорцина. В дополнение разработан тест in vitro с АТФ в качестве маркера жизнеспособности [20].

Доказана неодинаковая чувствительность к наночастицам различных линий клеток, что обязательно следует учитывать при оценке цитотоксичности наночастиц.

Таким образом, иисследование цитотоксичности может включать:

1. Определение повреждения мембран;

- подсчет с помощью световой микроскопии поврежденных и погибших клеток, окрашенных красителем (например, трипановым синим), пассивно поступающим внутрь;

- спектрофотометрическое определение живых клеток, активно захватывающих краситель (например, нейтральный красный);

- лизис клеток с высвобождением внутриклеточных ферментов (например, ЛДГ) в культуральную среду, спектрофотометрическое определение (доступны диагностические наборы).

2. Изучение внутриклеточных метаболических изменений;

- определение активности ферментов I и II фазы биотрансформации с помощью спектрометрии, масс-спектрометрии, газовой хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и др.;

- определение в МТТ-тесте нарушения функции митохондрий;

- определение содержания АТФ в клетках.

3. Изучение процессов апоптоза, вызывающего ряд биохимических и морфологических изменений, определяемых количественно;

- каспазной активности (в частности, каспазы-3);

- экспрессии Apaf-1, Bcl-2 протеинов Bax и Bid, p53.

Изучение воспалительных эффектов наноматериалов на различных культурах клеток человека in vitro необходимо для оценки потенциальной токсичности наночастиц. Цитокины, хемокины наряду с другими маркерами воспаления часто позволяют получить представление о механизме действия и токсичности наноматериалов. Использование соответствующих типов клеток человека имеет критическое значение.

Показано, что наночастицы способны проникать в клетки, минуя любые барьеры. Они способны к трансцитозу через эпителиальные и эндотелиальные клетки, распространяются по ходу дендритов и аксонов нервов, циркулируют в кровеносных и лимфатических сосудах, имеют тропность к определенным тканям. Опасение по поводу поступления наноччастиц в клетки, связанное с влиянием на здоровье человека и окружающую среду, побудило исследовтелей оценивать способность наноматериалов проникать через клеточные мембраны во внутриклеточные компартменты и ядро. Чтобы оценить риск, важно определить способ воздействия и решить, способны ли данные наночастицы проникать через мембраны клеток. Перемещение можно регистрировать с помощью конфокальной флюоресцентной микроскопии, трансмиссионной электронной микроскопии.

Из-за уникальных свойств и активности, наноматериалы могут пересекать клеточные мембраны, встраиваться в ДНК, повреждать белки. Как только "входные ворота" для наноматериалов определены, культуры клеток соответствующих тканей можно изучать в отношении повреждения протеинов и ДНК. Следует отдавать предпочтение культурам клеток человека.

Среди методов in vitro, применимых для изучения генотоксичности/мутагенности наноматериалов: тест Эймса, тест на хромосомные аберрации, тест на внеплановый синтез ДНК, тест на сестринский хроматидный обмен.

Каждый из тестов может быть частичной или полной заменой для методов in vivo. Отрицательные результаты теста не требуют проведения дополнительных исследований in vivo. Кроме того, генотоксичность можно оценивать, используя другие доступные, надежные методы, например, Cоmet тест.

Таким образом, достижения в области высоких технологий, аналитических методов позволяют проводить адекватное тестирование токсичности без использования животных. Электронная микроскопия и клеточные культуры, диагностические наборы предоставляют исследователям возможность оценивать клетки/органеллы/ДНК в ходе токсикологических исследований и регистрировать химические изменения в этих структурах, вызванные наноматериалами.

С точки зрения безопасности для здоровья человека и окружающей среды необходимо, чтобы нанотоксикология строилась на фундаменте надежных, адекватных тестов in vitro, позволяющих прогнозировать эффект наноматериалов.