Получение трансгенных растений, устойчивых к гербицидам

Одним из основных направлений биотехнологии растений является получение культурных растений, устойчивых к воздействию гербицидов. Гербициды широкого спектра действия, уничтожая сорные травы, оказывают угнетающее действие и на посевы. Получение устойчивых к гербицидам растений ведется в двух направлениях: во- первых, прямая селекция резистентных к гербицидам мутантных форм растений, во-вторых, получение трансгенных растений путем введения генов гербицид-резистентности любого происхождения как бактериального, так и растительного. Конструирование гербицидоустойчивых растений принадлежит к числу интенсивно разрабатываемых и энергично рекламируемых за рубежом генно-инженерных проектов в области сельскохозяйственной биотехнологии. Такая повышенная популярность определяется целым рядом причин. Во-первых, широкое применение гербицидов – непременная принадлежность новых интенсивных технологий в сельском хозяйстве. Достаточно сказать, что стоимость гербицидов, произведенных в США в 1984 г., составила 4 млрд долларов, причем эксперты прогнозируют дальнейшее расширение их применения. На смену прежним экологически опасным гербицидам широкого спектра действия, обладавшим токсичностью для млекопитающих и длительно сохранявшимся во внешней среде, приходят новые более совершенные и безопасные соединения.

Существенный недостаток многих высокоэффективных гербицидов – способность не только воздействовать на сорняки, но также подавлять и многие культурные растения. К числу таковых относится наиболее широко применяемый за рубежом гербицид глифосат. Он подавляет синтез ряда важнейших аминокислот и поэтому убивает не только сорняки, но и культурные виды растений, а также обладает токсичностью для бактерий и дрожжей. По этой причине получение культурных растений, устойчивых к гербицидам типа глифосат, представляет важную биотехнологическую задачу.

Применение гербицидоустойчивых растений позволит существенно видоизменить тактику борьбы с сорняками, достигнуть заметной экономии на вспашке, обработке почвы и прополке. По экспертным оценкам, ожидается, что экономия за счет гербицидоустойчивых томатов в Калифорнии может достичь солидной величины – порядка 30 долларов на акр. Гербицидоустойчивые растения будут иметь большое экономическое значение и станут существенным новым вкладом в развитие интенсивных технологий. Во-вторых, исследования последних лет, направленные на выяснение механизмов гербицидоустойчивости, позволили установить, что рассматриваемый признак у растений является моногенным, т. е. детерминируется чаще всего одним-единственным геном. Это обстоятельство открывает возможность использовать для решения данной проблемы весь арсенал технологии рекомбинантной ДНК. Важно отметить возможность использования как эмпирического, так и тео- ретически разработанного подходов к решению этой проблемы. С эмпирической точки зрения перспективна относительно легкая селекция на устойчивость к гербициду, добавляемому в среду мутантных клеток растений в условиях культуры in vitro, а также модельных объектов типа дрожжей и бактерий. Селекционированные в этих условиях гербицидорезистентные клетки далее могут быть регенерированы в растения, наделенные этим ценным хозяйственным признаком. В свою очередь, на возникших в результате мутаций гербицидоустойчивых растениях или микроорганизмах можно вести исследова- ние механизма устойчивости, а клонированные гены, детерминирующие этот признак, передавать с помощью генно-инженерных методов или обычных приемов гербицидочувствительному растению. Здесь эмпирический и теоретический подходы хорошо дополняют друг друга. С теоретической точки зрения существует четыре принципиально различных механизма, которые могут обеспечивать устойчивость к тем или иным химическим соединениям, включая и гербициды: транспортный, элиминирующий, регуляционный и контактный. Обычно химическое соединение, проникающее в клетку, попадает во внутриклеточное пространство путем активного транспорта через мембрану, который осуществляется либо с помощью специальных пермеазных систем, либо путем эндоцитоза с участием поверхностных рецепторов. В принципе возможно получить в результате мутации клетки с измененной или нарушенной системой транспорта данного вещества, неспособные переносить его внутрь клетки. Если речь идет о веществах, повреждающих или убивающих клетку, то такие непроницаемые для этих веществ клетки, естественно, станут к ним резистентными, в данном случае гербицидоустойчивыми. При действии элиминирующего механизма резистентности попавшие внутрь клетки вещества могут разрушаться с помощью индуцируемых клеточных факторов, чаще всего деградирующих ферментов, а также подвергаться тому или иному виду ферментативной модификации. В том и другом случае образуется неактивный безвредный для клетки продукт. При регуляционном пути возникновения устойчивости белок или фермент клетки, инактивирующийся в результате контакта с гербицидом, начинает по той или иной причине усиленно синтезиро- ваться в клетке, ликвидируя, таким образом, образовавшийся дефицит нужного метаболита. Наконец, при контактном механизме, когда ингибирующее или летальное действие гербицида реализуется путем его прямого взаимодействия с какимто клеточным ферментом или белком, путем мутации можно изменить структуру мишени таким образом, что она перестанет взаимодействовать с этой вредоносной молекулой. Различные механизмы гербицидорезистентности рассмотрены при анализе данных по отдельным видам этих соединений. В настоящее время обнаружено большое количество ферментов, разрушающих те или иные гербициды. Успехи достигнуты благодаря интенсивным целевым поискам в этом направлении, а также тому обстоятельству, что факторы элиминирующего механизма возникновения гербицидоустойчивости наиболее легко поддаются детекции в экспериментах in vitro с клеточными экстрантами или культурами клеток. В настоящее время целый ряд ферментов получен в очищенном виде, а для некоторых из них клонированы индивидуальные гены. Введение таких генов в растения, чувствительные к гербицидам, может обеспечить возникновение устойчивости при адекватной экспрессии гена в нужном клеточном компартменте и отсутствии цитотоксического действия его продукта в растительной клетке. Последнее обстоятельство – обычный камень преткновения для технологии рекомбинантной ДНК, обусловливающей появление в реципиентной клетке чужеродных белков с физиологической и ферментативной активностью. Типичным примером является случай с оксиге- назой нафталена, ген которой был перенесен из клеток Рseudomonas в клетки Е. соli. Эта оксигеназа атаковала индольное кольцо триптофана, вызывая его превращение в краску индиго, что приводило к окрашиванию в синий цвет и нарушению клеточного метаболизма. Сходная ситуации может возникать и при перенесении гена этого фермента в растительные клетки, где, как правило, присутствует много вторичных ароматических продуктов. Второй аспект проблемы нейтрализации гербицидов путем их разрушения или модификации в растительной клетке – возможное накопление продуктов деградации, если последние токсичны для потребителей этих рекомбинантных растений и не подвергаются деградации в самом растении или при его переработке до соединений, безвредных для человека и животных. По прогнозам, гербицидоустойчивые сорта важнейших сельско- хозяйственных культур станут к началу 90-х годов основой дальнейшего развития интенсивных биотехнологий в растениеводстве. Методами клеточной селекции были получены мутантные линии петуньи, в 20 раз более устойчивые к гербициду глифосату. Также селектированы суспензионные клеточные линии люцерны, способные расти в присутствии 600 мкМ гербицида Е фосфинотрицина, тогда как клетки дикого типа ингибируются концентрацией 25 мкМ. Получение растений, устойчивых к гербицидам, методами генной инженерии прежде всего основывается на изучении механизмов толерантности и включает следующие этапы: выявление мишеней действия гербицидов в клетке растений, отбор растений, устойчивых к данному гербициду, в качестве источника генов резистентности, идентификация и клонирование этих генов, изучение их экспрессии для использования в трансгенных конструкциях. В большинстве случаев биохимической мишенью о действия гербицидов являются физиологические процессы – фотосинтез или биосинтез аминокислот. Так, гербицид паракват, индуцирующий ксенобиотический стресс, и гербициды дифинилэфирного ряда, в том числе и ацифлуорфен, обладают гербицидной активностью благодаря способности ингибировать фотосинтез за счет активации свободных радикалов кислорода. Супероксид дисмутаза, кодируемая геном SOD, катализирует дисмутацию супероксидов в молекулярной кислород О2 и пероксид водорода Н2О2, Была получена кДНК гена SOD из табака и под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты была введена в составе вектора на основе Тi-плазмиды в геном люцерны. Кроме того, векторная конструкция содержала специфический- транзитный пептид для проникновения непосредственно в хлоропласты люцерны, биохимические процессы в которых и были непосредственной мишенью действия гербицидов. Анализ растений- трансформантов показал увеличение устойчивости к действию гербицидов ацифлуорфена и параквата, значительно превосходящей таковую у нетрансформированной люцерны. Другой гербицид – глифосат – угнетает рост растений, препятствуя биосинтезу ароматических аминокислот путем подавления фермента энолпирувил шикимат трифосфат синтетазы. У Salmonella typhimurium этот фермент кодируется геном aro А. Мутантный ген аго А, у которого в результате точковой мутации произошла замена триплетов серина, кодирующих аминокислоту серин на триплеты аминокислоты глицин, приводит к снижению связывания гербицида глифосата с ферментом. Была проведена трансформация растений табака векторными конструкциями, содержащими мутантный ген. Полученные трансгенные растения обладали повышенной устойчивостью к гербициду. Приведенные данные свидетельствуют о перспективности создания трансгенных растений, устойчивых к гербицидам.