Увеличение фотосинтетических возможностей культурных растений с помощью генной инженерии

Как известно, фотосинтез, осуществляемый растениями, характеризуется в целом весьма низкой эффективностью, так как фотосинтетический аппарат использует лишь 3 – 4 % падающего света. Низкая эффективность этого важнейшего для всей жизни на Земле процесса вызвана целым рядом причин от анатомо-физиологических до биохимических и молекулярно-генетических. Это обстоятельство открывает огромное поле деятельности по улучшению и усовершенствованию тех механизмов, которые изобрела природа, но не смогла модернизировать в процессе эволюции. Улучшать эффективность фотосинтеза в растениях можно с помощью как традиционной селекции, так и методов клеточной и генной инженерии. Однако ввиду того, что механизмы фотосинтеза и транспорта его продуктов до сих пор не могут считаться полностью расшифрованными, практическое улучшение фотосинтетических показателей и их влияния на урожайность пока ведется главным образом с помощью косвенных эмпирических подходов. Современный путь увеличения фотосинтетических возможностей культурных растений – селекция на предмет ускорения раннего роста и формирования листьев, улучшения «архитектуры» растений, увеличения площади листовой пластинки и сроков жизнедеятельно- сти этого органа. В то же время между скоростью фотосинтеза в листьях растений и их урожайностью прямая и однозначная зависимость отсутствует, что свидетельствует о достаточно высоком фотосинтетическом потенциале растений. Поэтому гораздо более важными с точки зрения повышения эффективности фотосинтеза и увеличения урожайности растений являются три других обстоятельства. Во-первых, способность растений к переносу продуктов фотосинтеза в те его части, ради которых данное растение культивируется. Поскольку детали этого регуляторного механизма в настоящее время еще не установлены, вряд ли можно ожидать быстрого вклада генной и клеточной инженерии в решение данной проблемы, хотя в будущем улучшение транспорта продуктов фотосинтеза, несомненно, послужит важным источником повышения урожайности. Во-вторых, значительная часть углерода, ассимилируемого растениями в результате фотосинтеза, тратится ими в процессе фотодыхания, она могла бы быть без ущерба для растений существенно уменьшена. Хотя радикальных путей решения этой задачи пока не найдено, тем не менее с помощью регуляторов роста, потери сухого вещества в результате дыхания можно уменьшить. В-третьих, известны две большие группы сельскохозяйственных культиваров, так называемые С3 и С4- растения, различающиеся по первичным темновым реакциям фотосинтеза. У представителей первой группы растений основным продуктом связывания СО2 являются трехуглеродные соединения, а у представителей второй группы – четырехуглеродные соединения. В результате эффективность фотосинтеза у растений С4-группы, к которой, в частности, принадлежат кукуруза, сорго, сахарный тростник и многие другие тропические растения, как минимум вдвое больше, чем у растений С3-типа, к которым относятся важнейшие злаковые культуры. Наличие столь значительных физиолого-биохимических различий у представителей одного и того же семейства мятликовых делает достаточно реальным трансгеноз группы генов, обеспечивающих высокую эффективность фотосинтеза, например, от кукурузы другим видам этого семейства.. Для оценки перспективности тех или иных генно-инженерных подходов к повышению эффективности фотосинтеза целесообразно рассмотреть ранние темновые реакции связывания СО2 у различных растений. Как известно, у всех без исключения растений связывание СО2 осуществляется через цикл восстановления углерода Кальвина. Первый этап представляет собой карбоксилирование, которое у С3- растений происходит путем взаимодействия свободного СО2 с основным доступным акцептором – рибулозо-1,5-бифосфатом, в результате чего образуются две молекулы 3-фосфоглицерата. Реакция проходит через стадию нестабильного 6-членного производного, которое быстро гидролизуется в клетке с образованием двух молекул фосфоглицерата. Эта реакция катализируется карбоксилазой рибулозо-1,5-бифосфата (РБК). РБК локализована на обращенной к строме поверхности мембран тилакоидов, ее содержание в хлоропластах достигает 16 % тотального белка этой органеллы. Описанная реакция карбоксилирования рибулозо-1,5-бифосфата, катализируемая РБК является лимитирующей стадией в функционировании цикла Кальвина. У растений и фотосинтезирующих микроорганизмов на свету происходит ускорение этой стадии за счет активации РБК. Активация достигается трояким способом. NАDР*Н, образуемый фо- тосистемой I, служит аллостерическим активатором этого фермента; индуцированное светом закисление полости тилакоида обусловливает и одновременное защелачивание стромы протопласта, где локализована РБК, и освобождение Мg2+. В итоге наблюдается активация РБК, имеющей, как известно, щелочной оптимум рН и активируемой Мg2+. Второй стадией цикла является восстановление 3- фосфоглицерата за счет энергии фотореакции до триозофосфата. На первой стадии цикла у С4-растений акцептором СО2 в форме бикарбоната выступает не рибулозо-1,5-бифосфат, а фосфоенолпиру- ват, который в результате реакции карбоксилирования превращается в оксалоацетат. Последний далее может трансформироваться в малат и аспартат. Эта реакция карбоксилирования осуществляется ферментом, специфическим для растений С4-типа – фосфоенолпируват- карбоксилазой (фЕПК). Основное значение этого дополнительного этапа к циклу Кальвина у С4-растений состоит в том, что ФЕПК и субстрат расположены в мезофильных клетках, соприкасающихся с воздухом, а образовавшиеся С4-соединения транспортируются в клетки обкладки сосудистого пучка, которые служат основным местом локализации фотосинтетической системы и компонентов цикла Кальвина. Здесь образовавшиеся под влиянием ФЕПК С4-соединения подвергаются декарбоксилированию под действием NАDР+- зависимой малатдегидрогеназы. В результате в клетках обкладки сосудистого пучка создается очень высокая концентрация СО2, который затем вступает в обычный цикл Кальвина: с участием уже описанной РБК происходит конденсация СО2 и рибулозо-1,5-бифосфата с последующим образованием 3'-фосфоглицерата. Таким образом, дополнительная стадия с участием ФЕПК, по существу, представляет собой углекислую помпу, не только перекачивающую СО2 в клетки, где сосредоточены компоненты цикла Кальвина, но и создающую там высокую локальную концентрацию СО2, необходимую для эффективной работы фотосинтезирующей системы. В хлоропластах С4-растений соотношение СО2/О2 оказывается значительно более высоким и бла- гоприятным для карбоксилазной активности РБК по сравнению с хлоропластами С3-растений, что и обеспечивает повышенную эффективность фотосинтеза у растений первого типа. Искусственное повышение концентраций СО2 в фитотронах приводило к увеличению соотношения СО2/О2 в хлоропластах С3-растений и последующему повышению скорости фотосинтеза до уровня, характерного для С4- растений. Однако необходимо отметить, что за это преимущество С4- растения расплачиваются более высокими энергетическими затратами по сравнению с растениями С3-типа. В первом случае на одну молекулу образовавшейся гексозы затрачивается 30 молекул АТФ, а во втором случаелишь 18. Возможно, поэтому С4-путь темновой фик- сации СО2 получил распространение главным образом у южных и тропических растений. В то же время усиленный расход АТФ у С4- растений в цикле Кальвина компенсируется выигрышем энергии за счет подавления фотодыхания. Помимо механизма концентрации СО2, существенное значение для повышения эффективности фотосинтеза имеют также и каталитические свойства центрального фермента фотосинтеза – РБК. Этот фермент, естественно, присутствует во всех фотосинтезирующих организмах (растениях, бактериях и водорослях) и выполняет двойственную функцию: карбоксилазы и оксигеназы. В своей первом случае РБК катализирует связывание СО2 или НСО2, что, собственно, и представляет собой первую стадию фотосинтеза. РБК составляет основную массу белков в фотосинтезирующих органеллах. Возможно, это в определенной степени связано с его весьма низкой каталитической активностью: скорость оборота РБК не превышает 0,3с. В своей оксигеназной особенности РБК катализирует первую стадию в цепи фотодыхания, начинающуюся с окисления того же рибулозобифосфата. По существу, карбоксилазная и оксигеназная активности представляют собой конкурентные биохимические реакции, причем в процессе фотодыхания расходуется углерод, накопленный в результате фотосинтетической реакции. В итоге растение выделяет в окружающую среду углекислый газ и аммиак, что представляет собой чистые потери органической материи и энергии. Предпринимавшиеся попытки с помощью индуцированного мутагенеза и селекции получить молекулу РБК с уменьшенной оксигеназной активностью пока заканчивались неудачей, в связи с чем основное внимание в генно-инженерных экспериментах и селекционно- генетических работах уделяется уже упоминавшемуся механизму концентрации СО2, с одной стороны, и повышению сродства РБК и СО2 – с другой. Уповая на будущие успехи генной инженерии, не следует упускать из виду и сегодняшние возможности увеличения продуктивности фотосинтеза с помощью более традиционных методов. В частности, этому нередко способствует полиплоидизация рас- тений. У тетраплоидной люцерны описано двукратное увеличение активности РБК, сопровождавшееся соответственно и увеличением фиксации СО2. Однако дальнейшее увеличение плоидности не сказывалось заметным образом на фотосинтетическом потенциале растений, активность РБК и уровень фиксации СО2 у октаплоидной люцерны оставались на том же уровне, что и у тетраплоидов. Сравнительное изучение свойств РБК, выделенных из разных источников, продемонстрировало, что сродство к СО2 у фермента из С3-растений значительно выше по сравнению с С4-типом РБК. Помимо сродства к СО2, существенное значение для эффективности фотосинтеза могут иметь и другие особенности РБК, в частности ее общая ферментативная активность, поскольку эффективность связывания СО2 значительно варьирует в пределах С3 или С4-групп растений. В расчете на единицу содержания хлорофилла активность РБК С4-типа в среднем в 60 раз превосходит таковую для С3-растений, хотя причины этих различий, равно как и индивидуальных различий в пределах названных групп, не установлены. По всей видимости, они связаны со свойствами самой молекулы фермента, поскольку разные РБК заметно различаются по аминокислотному составу, причем различия наиболее выражены у малой субъединицы. Таким образом, более высокая эффективность фотосинтеза у С4-растений определяется, с одной стороны, репрессией фотодыхания, а с другой – увеличением связывания СО2 за счет свойств самого фермента (увеличение сродства к СО2и времени оборота). Однако, наряду с возможностями улучшения фиксации СО2 у С3-растений за счет переноса в них соответствующих генов С4-типа, обращают на себя внимание и отдельные виды С3-растений, например, подсолнечник, эффективность фотосинтеза у которого не уступает кукурузе. Удельная активность РБК подсолнечника оказалась выше, чем у других С3-растений, но пока не установлено, объясняется ли повышение эффективности связывания СО2 только особыми свойствами самой молекулы РБК или другими физиологическими особен- ностями подсолнечника. В любом случае для успешного осуществления генно-инженерных манипуляций с генами РБК и других белков, причастных к связыванию СО2, необходимы дальнейшие молекулярно-биологические и генетические исследования. В настоящее время перед генными инженерами, работающими в области фотосинтеза, четко сформулирована задача: исследовать возможности получения РБК с соотношением карбоксилазной и оксигеназной активностей, измененным в пользу карбоксилазы. Согласно подсчетам, полное устранение оксигеназной активности у РБК могло бы повысить эффективность фотосинтеза у растений С4-типа на 45 – 50 %. Половину этого выигрыша можно было бы отнести за счет прекращения потерь СО2 в процессе фотодыхания, а вторую половину – за счет ингибирующего действия О2 на карбоксилазную активность РБК. Конечно, вряд ли можно рассчитывать на полную элиминацию способности РБК катализировать окисление рибулозобифосфата, поскольку оба вида каталитической активности РБК являются, очевидно, неизбежным следствием химических особенностей превращений субстрата (рибулозофосфата) в хлоропластах. Дело в том, что промежуточный продукт, образующийся при взаимодействии РБК с рибулозобифосфатом, сам по себе чувствителен к кислородной атаке. Очевидно, в силу высокого фотосинтетического потенциала растений, заведомо достаточного для обеспечения их жизнедеятельности и репродукции, эволюция не создала селекционного давления, направленного на отбор фотосинтезирующего фермента типа РБК с минимальной или отсутствующей оксигеназной активностью. И оксигеназная, и карбоксилазная активности определяются одним и тем же активным центром РБК, поэтому простое удаление части молекулы РБК с оксигеназным доменом здесь оказывается не- возможным ввиду отсутствия самого домена. РБК заметно отличается от обычных канонических оксигеназ – последние, как правило, содержат флавиновые группы или металлы в качестве кофактора, необходимого для проявления их активности. Поскольку в молекуле РБК эти кофакторы отсутствуют, предполагается, что оксигеназная активность в отношении рибулозобифосфата связана лишь с 1–2 аминокислотными остатками, входящими в состав общего активного центра и несущественными для проявления карбоисилазной активности. Идея возможного разобщения карбоксилазной и оксигеназной активностей в молекуле РБК подтверждается и тем, что замена Мg на Мn в нативных препаратах растительных РБК почти полностью устраняет карбоксилазную активность, практически не затрагивая активности оксигеназы. К сожалению, биохимики и физиологи пока не нашли кофактора, способного воздействовать на эти активности РБК в обратную сторону, подавляя оксигеназу. Кроме того, данные о соотношении оксигеназной и карбоксилазной активностей у РБК различного происхождения свидетельствуют о том, что эта величина у разных растений может различаться практически на порядок.Таким образом, теоретически возможно путем контролируемых изменений в активном центре РБК понизить ее способность связывать кислород в 10 раз. В свете сегодняшних возможностей генно- инженерного подхода наиболее реальным путем к решению поставленной задачи является сайт-специфический мутагенез с помощью синтетических олигонуклеотидов, позволяющий заменять отдельные строго определенные аминокислоты на другие, опять-таки строго определенные виды аминокислот. Для рационального осуществления этой операции, представляющей собой типичный пример инженерии белков, необходимо точное и полное знание структуры РБК, и особенно ее активного центра, чему в настоящее время уделяется самое пристальное внимание. В результате многочисленных исследований, выполненных за последние 4–5 лет, установлено, что у всех фотосинтезирующих эукариотических организмов и у многих фотосинтезирующих прокариотических организмов РБК представлена двумя субьединицами: большой (L), осуществляющей каталитические функции (молекулярная масса около 52 кД), и малой (S), выполняющей функции актива- ционные и структурные (молекулярная масса около 14 кД). Гены многих фотосинтезирующих объектов, кодирующих эти субъединицы РБК, в настоящее время клонированы, для них определена полная нуклеотидная последовательность. У растений I-субъединица РБК кодируется геном, локализованным в ДНК хлоропластов, где также происходит и синтез этого белка. Малая S-субъединица РБК кодируется ядерным геном и синтезируется в цитоплазме в форме предшественника, транспортируемого затем в хлоропласты. Полная активная молекула РБК, содержащая по L и S- субъединиц, собирается в хлоропластах после транспорта туда S- субъединиц и их соответствующего процессинга. Такой же гексадекамер из 8L и 8S-субъединиц формируется у некоторых фотосинтезирующих цианобактерий и у некоторых других фотосинтезирующих прокариотов. В каталитических свойствах и структурной организации прокариотического и растительного мультимерного комплекса РБК оказалось много общего. Гомология между L-субъединицами растительного и бактериального происхождения составляет около 75% при расчете по последовательности нуклеотидов в гене и до 85% при расчете по последовательности аминокислот в полипептидной цепи. Более простая организация РБК оказалась у некоторых фотосинтезирующих бактерий из рода родоспирилл и родопсевдомонад. Так, у Rhodospirillum rubrum, в частности, полная ферментативная активность РБК, включая и оксигеназу, была присуща белку с молекулярной массой 55 кД, который имел лишь небольшую гощологию с ферментом, состоящим из двух субъединиц. Никакой малой субъединицы у ферментов этого типа обнаружить не удалось, равно как и формирования сложных мультимерных комплексов. Биологически активной формой РБК К. гпЬгшп оказался димер 55К субъединиц. Сборка димера из мономерных белков происходит спонтанно без участия особых кофакторов, поскольку РБК R. rubrum, синтезированная на матрице рекомбинантной ДНК в клетках Е. со1i, состояла из двух идентичных субъединиц и не отличалась по своим свойствам от аутентичного фермента, синтезированного в гомологичных клетках. Интерес исследователей к бактериальным РБК, состоящим как из двух различных субъединиц, так и из однотипных субьединиц, обусловлен тем, что аналогичные ферменты растительного происхождения оказались весьма лабильными. Так, диссоциация РБК до субъединиц вела к ее необратимой денатурации, и реассоциацию L и S-субьединиц растительного происхождения осуществить в экспериментах ничего не удалось. Клонированные гены L и S-субьединиц РБК из кукурузы, пшеницы и гороха программировали в бактериях синтез лишь мономерных L и S полипептидных цепей, которые ни по физическим свойствам, ни изменить соотношение двух каталитических активностей в пользу карбоксилазы не могли. Сравнение ферментов мутантного и дикого типов показало, что мутация вызывала изменение каталитических свойств фермента, но, к сожалению, она в равной мере сказалась и на карбоксилазной, и на оксигеназной активностях, которые снизи- лись примерно на 30 % каждая. Не вызывает сомнений, что задуманная реконструкция молекулы РБК путем направленного сайт-специфического мутагенеза будет продолжаться и описанные эксперименты являются лишь началом большой и скрупулезной работы по целенаправленному изменению свойств ее активного центра. Необходимо подчеркнуть, что работа такого рода сильно тормозится отсутствием точной модели структуры, особенно ее активного центра, основанной на результатах рентгеноструктурного анализа. Полученные картины дифракции лучей Рентгена препаратами РБК пока не дают возможности создать адекватную пространственную модель структуры. Наряду с программой перестройки молекулы РБК методами белковой инженерии, рассчитанной на длительное время, выдвинуто еще несколько проектов улучшения фотосинтетических показателей растений, о практической реализации которых сведений пока нет. Выше уже шла речь об общей идее трансгеноза детерминант С4- растений, определяющих высокую эффективность связывания СО2, хотя эта функция программируется большим количеством разнообразных генов, что сильно осложняет достижение поставленной цели. Более простой задачей явился бы перенос генов фосфоенолпируват карбоксилазы и декарбоксилазы в Сз-растения, не элиминирующий при этом собственной РБК С3-типа и всей сопутствующей системы карбоксилирования. В результате локальная концентрация СО₂ в хлоропластах трансформированных растений могла бы заметно возрасти со всеми вытекающими отсюда благоприятными последствиями. Существует мнение, что этого же эффекта можно достигнуть путем трансгеноза гена ангидразы либо путем его амплификации, что должно привести к усилению синтеза ангидразы и ее транспорта в хлоропласты. Результатом явилось бы повышение концентрации НСО₃ в этих органеллах. Недавно выдвинута идея изменить неблагоприятное для карбоксилазной активности РБК соотношение СО2/О2 в хлоропластах путем введения в геном хлоропластов гена леггемоглобина. Этот белок кодируется генами ряда бобовых растений, вступающих в симбиоз с азотфиксирующими ризобиями, и транспортируется в корневые клубеньки. Нитрогеназный комплекс клубеньков, как и карбокеилазная активность РБК, ингибируется свободным кислородом, и функции леггемоглобина в клубеньках как раз и состоят в понижении внутриклеточной концентрации О₂ путем его обратимого связывания. Не ясно лишь, как поведет себя леггемоглобин в хлоропластах и как он будет влиять на другие стадии фотосинтетического процесса. Так или иначе, но проблема генно-инженерного улучшения эффективности фотосинтеза в растениях привлекает к себе самое пристальное внимание, хотя, по мнению экспертов, практических результатов от ее решения можно ожидать не ранее середины 90-х годов.