Культура изолированных клеток и тканей. Клональное микроразмножение и оздоровление растений

1.2.1. Гибридизация соматических клеток.

Разработка способов индукции слияния протопластов вместе с развитием экспериментальной техники культивирования клеток in vitro, дающей возможность получения изолированных протопластов.

Сущность этого способа гибридизации заключается в том, что в качестве родительских используются не половые клетки (гаметы), а клетки тела (сомы) растений, из которых изолируют протопласты. И в отличие от полового скрещивания, где имеет место одностороннее исключение протоплазмы, при соматической гибридизации в образовавшемся гибриде оба партнера имеют более или менее равный цитоплазматический статус. Слияние протопластов способствует объединению двух различных цитоплазм. В большинстве исследований слияние протопластов высших растений приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида. Цибридное растение содержит цитоплазму обоих партнеров, ядро – одного. Образование растения с гибридной цитоплазмой и органеллами обоих партнеров, но содержащее в своих клетках ядро только одного вида, возможно в том случае, если после слияния протопластов не происходит соединения ядер и одно ядро дегенерирует. Важным моментом в изучении индуцированного слияния двух неродственных протопластов является селективный маркер, используемый для идентификации продукта гетероплазматического слияния, так как эффект индуктора не специфичен и вызывает агрегацию и слияния протопластов одного и того же вида и различных видов. Для идентификации гетероплазматического продукта могут служить пластиды.Так например при межродовом слиянии протопластов табака и моркови как селективные маркеры использовались зеленые хлоропласты табака и красные, содержащие антоциан, протопласты моркови. Кроме пластид могут быть использованы биохимические или генетические маркеры, такие, как изоэнзимный состав, структура нуклеиновых кислот, устойчивость к наркотикам, число хромосом, кариотипы. Первое сообщение об успешном получении зрелого межвидового гибридного растения методом соматической гибридизации было сделано П. Карлсоном с сотрудником (P. Carlson et al., 1972). Были использованы протопласты двух видов табака: Nicotianu glauca (2N = 24) и N. langsdorffii (2N=18). Идентификация гетероплазматического продукта проводилась по способности протопластов расти на среде Нагата и Такебе. Протопласты N. glauca и N. langsdorffii, хотя и образовывали клеточные стенки, но не могли осуществить более чем одно деление, в то время как протопласты амфидиплоидного гибрида повторно делились и формировали каллусную массу. Другая характерная черта этого гибридного каллуса – его способность активно расти на среде без добавления гормонов, что дало возможность создать второй способ селекции. В этих опытах слияние протопластов N. glauca и N. langsdorffii стимулировалось NаNОз(0,25 моль/л). После этапа слияния популяция, содержащая протопласты обоих родителей и гетерокарионы, платировалась на среду Нагата и Такебе. На ней росли только гибридные клетки. Через 6 недель роста было получено 33 каллуса. Они выращивались на среде без добавления гормонов. Каллус дифференцировал проростки. Далее было получено гибридное растение, кото- рое цвело. Растения соматических гибридов были идентичны амфи- диплоидным половым гибридам по морфологии, числу хромосом, а также изоэнзимному составу пероксидазы. В успешной работе по созданию межвидового гибрида Pettjinia на основе соматической гибридизации Д. Поува с сотрудниками использовал две селективные схемы. Первая основана на различиях в условиях роста, необходимых протопластам, и на неодинаковой чувствительности к антимицину D. Во второй схеме для селекции гибридов была разработана альбиносно-комплементарная методика, которая состояла в слиянии протопластов альбиносного P. hybrida с протопластами из мезофилла листа P. parodii. Отбирались зеленые формы как результат комплементации и селективного роста. Полученные в итоге растения классифицировались как соматический гибрид на основе изоэнзимных спектров пероксидазы, числа хромосом, цвета венчика, величины и общей морфологии растения. При создании соматического гибрида Daucus carota и D. capillifolius протопласты изолировались из культуры клеток альбиносной моркови (D. carota) и нормально зеленой D. capillifolius. Слияние индуцировали ПЭГ. Главным признаком для селекции соматического гибрида было восстановление фотосинтетической функции. В ряде случаев для гибридизации используются комплементарные хлорофиллдефицитные мутанты. Г. Мелхерс и Г. Лабиб осуществили слияние протопластов двух хлорофиллдефицитных светочув- ствительных разновидностей N. tabacum (гаплоид). Гибрид изолировали по чувствительности к высокой интенсивности света и по нормальной окраске листьев. Р. Г. Бутенко, Ю. Ю. Глеба и К. М. Сытник использовали пест- ролистный пластомный мутант табака сорта Самсун и ядерный мутант серного табака сорта Дж. Вильямса. Мезофильные протопласты белых участков листа первого мутанта сливали с протопластами сеянцев второго. Сеянцы были гомозиготны по дефектному гену Su. Гибридные продукты восстанавливали способность к фотосинтезу в результате ядернопластомной комплементации. В 1978 году получили регенерацию соматического гибрида картофеля и томатов. Протопласты мезофилла Lycopersicon esculentum Millvar желтозеленого мутанта и протопласты, полученные из каллусной культуры диплоидного штамма Solarium tuberosum L., сливали на первом этапе в присутствии ПЭГ, а затем – ионов кальция в высокой концентрации. После слияния протопласты делились, образовывали каллусные массы, в некоторых из них формировались нормальные зеленые проростки. Их либо высаживали в почву, либо при- вивали на ствол томата. Одно из направлений клеточных технологий – это использование их в селекции, которое облегчает и ускоряет традиционный се- лекционный процесс в создании новых форм и сортов растений.

Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro условно можно разделить на две группы. Первая группа – это вспомогательные технологии, которые не подменяют обычную селекцию, а служат ей. К ним можно отнести: оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости), культивирование семяпочек и незрелых гибридных зародышей (преодоление постгамной несовместимости), получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор, криосохранение изолированных клеток, тканей и органов, клональное микроразмножение от- даленных гибридов.

Вторая группа методов ведет к самостоятельному, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений: клеточная селекция с использованием каллусной ткани, соматическая гибридизация (слияние изолированных протопластов и получение неполовых гибридов), применение методов генной инженерии. Протопласты растений представляют собой отправную точку многих методик, используемых для генетической модификации целых растений и их клеток. Изолированный протопласт – клетку лишенную стенки можно заставить слиться с протопластами других видов растений и получить таким образом новые гибридные растения (соматическая гибридизация). Кроме того, протопласт является идиальным реципиентом для чужеродной ДНК, которая часто представляет собой плазмиды. Такая трансформация, обеспечивая проникно- вение и последующую экспрессию этой ДНК, может приводить к об- разованию генетически модифицированных растений.

Методы выделения протопластов. Успешное выделение протопластов зависит от многих факторов, например, типа ткани (лист, клеточная суспензия, семядоля, корень), вида растения и сорта, смеси ферментов и физиологического состояния растения. Однако проблема жизнеспособности протопластов возникает не только после их выделения, но и после различных манипуляций с ними. Создание неполовых гибридов путем слияния изолированных протопластов, полученных из соматических клеток, позволяет скре щивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрестить обычным половым путем, вызывать слияние трех и более родительских клеток, получать асимметричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами или генами, или только органеллами и цитоплазмой другого.

Гибридизация соматических клеток дает возможность не только соединить в одном ядре гены далеких видов растений, но и сочетать в гибридной клетке цитоплазматические гены партнеров. Выделение, культивирование и слияние изолированных протопластов. Для применения методов соматической гибридизации необходима разработка соответствующих технологий получения протопластов, способных делиться и регенерировать растения. Выделение протопластов растительных клеток путем их плазмолизирования и механического разрушения клеточной стенки было осуществлено еще в конце XIX в. Однако метод изолированных протопластов получил развитие лишь после того, как И.К. Коккинг (1960) впервые осуществил ферментативное разрушение клеточной стенки и выделил голые протопласты. В настоящее время продолжаются разработка и совершенствование методов выделения и культивирования протопластов на искусственных питательных средах. Для культивирования протопластов применяют те же питательные среды, что и для культуры изолированных клеток и тканей. Отличительной чертой сред для протопластов является повышенное осмотическое давление на начальных эта- пах культивирования, которое обеспечивается высокой концентрацией маннита или СаСl2. В процессе культивирования изолированные протопласты реге- нерируют новую клеточную стенку и превращаются в клетки, способные делиться и давать начало образованию каллусной ткани. На формирование колоний протопластами влияет состав питательной среды. Дальнейшая задача – получение из каллусной ткани растений- регенерантов. Пока не удалось получить регенеранты из протопластов многих злаковых (пшеницы, ячменя). Однако успешно осуществляется регенерация из протопластов пасленовых (табак, картофель, томаты) и других культур. Протопласты выделяют из каллусных, суспензионных клеток или из клеток листьев, меристем, стеблей. При выделении протопластов из листьев сначала удаляют эпидермис, лист нарезают на сегменты и затем подвергают энзиматической обработке пектиназой и целлюлозой. Слияние изолированных протопластов может происходить спонтанно, но довольно редко. Индуцированное слияние изолированных протопластов впервые было получено в лаборатории Коккинга в 1970 г. его сотрудником Пауэром и др. В качестве индуктора они ис- пользовали нитрат натрия. Но этот метод оказался малоэффективным, и сейчас найдены другие фьюзогены (индукторы слияния). Наиболее эффективными из них оказались растворы с высоким рН (9–11) и высокой концентрацией ионов кальция (100–300 мМ). Протопласты предварительно агглютинируют с помощью концентрированных растворов полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500–6000. У. Циммерман с сотрудниками разработали физический метод слияния протопластов животных клеток, липосом, в котором в качестве индуктора использовались импульсы электрического тока. Слияние протопластов приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида. Цибридная клетка содержит цитоплазму обоих парт- неров, а ядро – одного. Это возможно в том случае, если после слия- ния протопластов не происходит соединения ядер, и одно ядро деге- 34 нерирует. Образование цибрида возможно и в том случае, если один из протопластов лишен ядра или оно инактивировано путем облуче- ния. Цибридизация позволяет ввести цитоплазматические гены, не- сущие признаки ЦМС (цитоплазматической мужской стерильности), устойчивости к некоторым гербицидам и патогенам. В настоящее время методом парасексуальной гибридизации по- лучено большое число межвидовых, межсемейственных и межтриб- ных гибридов. Однако во многих случаях гибридные растения, полу- ченные таким путем, в той или иной степени ненормальны. Приме- ром может служить соматический гибрид между арабидопсисом и турнепсом, который является растением-монстром. Возникающие аномалии являются результатом хромосомной несбалансированности. Особый интерес представляют межцарственные клеточные гиб- риды, полученные от слияния протопластов растительных и живот- ных клеток. Описаны гибриды между протопластами эритроцитов крысы и протопластами дрожжевых клеток, между протопластами моркови и человека, табака и человека и др. При соматической гибридизации эксперимент строится анало- гично опытам по генетике микроорганизмов. Иными словами, ис- пользуются большие популяции клеток обоих родителей. При обра- ботке смешанной суспензии протопластов фьюзогенами часть из них сливается друг с другом, но в суспензии остаются и неслившиеся протопласты. Все они, включая гибридные, в дальнейшем регенери- руют клеточные стенки и переходят к делениям. Возникает задача — выделить из общей массы гибридные экземпляры. Селекция гибридов может применяться либо на клеточном уровне, либо на стадии регенерации и осуществляется несколькими методами Для идентификации гибридов могут служить пластиды. Например, при слиянии протопластов табака и моркови в качестве селек- тивных маркеров использовались зеленые хлоропласты табака и красно-оранжевые хромопласты моркови. Другим методом, позволяющим производить отбор гибридов, является генетическая комплементация. Этот метод был применен для обнаружения гибридов табака, при этом использовались хлорофилл дефектные мутации у родителей с последующей комплемента- цией в гибридных продуктах. Сочетание двух ядерных рецессивных мутаций у табака вызывает светозависимую хлорофильную недоста- 35 точность. Растения, гомозигготные по любому из этих генов, выра- щиваемые при интенсивном освещении, обесцвечиваются и гибнут. После слияния и регенерации клеточные колонии пересаживают на среду, индуцирующую стеблевой органогенез, и культивируют на свету. Под методом физиологической комплементации, который также используется для обнаружения соматических гибридов, подразуме- вают способность гибридных клеток жить и размножаться либо пере- ходить к морфогенезу в условиях культуры, при которых родительские клетки этого делать не в состоянии, причем неспособность родительских клеток не связана с какой-нибудь определенной мутацией, а является нормальной физиологической реакцией клетки на физиологические условия. Гормононезависимость клеток гибрида и была положена в осно- ву метода селекции. После индуцированного слияния протопластов из мезофилла листьев обоих видов табака клетки через некоторое время пересаживали на питательную среду, не содержащую фитогормонов, и отбирали колонии, способные расти в этих условиях. Существуют также другие методы селекции соматических гибридов: смешанная физиологогенетическая комплементация, физическое обогащение (метод основан на разделении протопластов при центрифугировании в связи с их различной плотностью), механическая изоля- ция. Использование изолированных протопластов в селекции растений не ограничивается возможностью их индуцированного слияния и получения соматических гибридов. Изолированные протопласты способны поглощать из окружающей среды макромолекулы и органеллы, следовательно, в них можно вводить чужеродную информацию, не пересаживая ДНК или органеллы других клеток. Уже проведена успешная трансплантация изолированных ядер в протопласты петунии и табака. Вместе с тем поглощение протопластами чужеродных ядер не всегда ведет к образованию гибридов. Кроме ядер в изолированные протопласты удалось трансплантировать чужеродные хлоро- пласты. Из этих протопластов Карлсон получил растения- регенеранты, содержащие хлоропласты другого организма.

Клональное микроразмножение

Для семенных растений характерно два способа размножения: семенной и вегетативный. Оба эти способа имеют как преимущества, так и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести, в первую очередь, генетическую пестроту получаемого посадочного материала и длительность ювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной. Это обусловлено следующими причинами: 1) не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью (дуб, сосна, ель, орехоплодные и др.); 2) практически невозможно с помощью черенкования размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10—15 лет; 3) не всегда удается получать стандартный посадочный материал (возможность накопления и передачи инфекции); 4) трудоемкостью и сложностью операций при размножении взрослых (древесных) растений с помощью прививок; 5) неэффективностью разработанных технологий для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года. Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения — клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке), неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотент- ность, т. е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму. Этот метод, несомненно, имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения: получение генетически однородного посадочного материала; освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры; высокий коэффициент размножения (105—106 — для травя- нистых, цветочных растений, 104—105 — для кустарниковых древесных, 104 — для хвойных); сокращение продолжительности селекционного процесса; ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной стадии.

Первые достижения в области клонального микроразмножения были получены в конце 50-х годов XX столетия французским ученым Жоржем Морелем, которому удалось получить первые растения- регенеранты орхидей. Успеху Ж. Мореля в микроразмножении способствовала уже разработанная к тому времени техника культивирования апикальной меристемы растений в условиях in vitro. Как правило, исследователи в качестве первичного экспланта использовали верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризантемы, подсолнечника, гороха, кукурузы, одуванчика, салата и изучали влияние состава питательной среды на процессы регенерации и формирования растений. В нашей стране работы по клональному микроразмножению были начаты в 60-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Под руководством проф. Р.Г. Бутенко были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы, фрезии и некоторых других растений и предложены промышленные технологии. Таким образом, первые успехи в клональном микроразмножении связаны с культивированием апикальных меристем травянистых растений на соответствующих питательных средах, обеспечивающих в конечном итоге получение растений-регенерантов. Однако область применения микроразмножения разнообразна и имеет тенденцию к постоянному расширению. Это в первую очередь относится к размножению in vitro взрослых древесных пород, особенно хвойных, и использование техники in vitro для сохранения редких и исчезающих видов лекарственных растений. В настоящее время в этом направлении наметился положительный сдвиг. Первые работы по культуре тканей древесных растений были опубликованы в середине 20-х годов XX столетия и связаны с именем французского ученого Готре. В них сообщалось о способности камбиальных тканей некоторых видов вяза и сосны к каллусогенезу in vitro. В последующих работах 40-х годов была выяснена способность различных тканей вяза листового к образованию адвентивных почек. Однако дальнейший рост и формирование побегов авторами не были получены. Лишь к середине 60-х годов Матесу удалось получить первые растения-регенеранты осины, которые были доведены до почвенной культуры. Культивирование тканей хвойных пород in vitro долгое время использовалось как объект исследования. Это было связано со специфическими трудностями культивирования ювенильных и тем более взрослых тканей, изолированных с растения. Известно, что древесные, и особенно хвойные ракстения, характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений (фенолы, терпены и другие вещества), которые в изолированных тканях окисляются различными фенолазами. В свою очередь, продукты окисления фенолов обычно ингибируют деление и рост клеток, что ведет к гибели первичного экспланта или к уменьшению способности тканей древесных пород к регенерации адвентивных почек, которая с возрастом растения-донора постепенно исчезает полностью.

Однако, несмотря на все трудности, ученые все чаще используют в качестве объектов исследований различные ткани и органы древесных растений. В настоящее время насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro (каштан, дуб, береза, клен, осина, гибриды тополей с осиной, сосна, ель, секвойя и др.), а работы в этом направлении ведутся в научных учреждениях Москвы, Санкт-Петербурга, Воронежа, Уфы, Новосибирска, Архангельска, Киева и др.