Повышение устойчивости растения к ранним заморозкам

Устойчивость растений к заморозкам, являющаяся частью более общей проблемы морозостойкости,– это сложный комплексный признак, зависящий как от физиологических и биохимических особенностей самого растения, так и от внешних причин. В настоящее время об эндогенных механизмах этой устойчивости известно мало, можно ограничиться кратким определением устойчивости (чувствительности) растений к заморозкам как способности (неспособности) противостоять механическим повреждениям их тканей кристаллами, образующимися при низкой температуре. С этой точки зрения устойчивые растения определяются как слабоповреждаемые, а чувствительные – как сильноповреждаемые, хотя внутренние молекулярные механизмы этих различий остаются неизвестными. Гораздо лучше изучены внешние механизмы, определяющие поражение растений заморозками. Сам термин «заморозки» подчеркивает, что речь идет об относительно кратковременных воздействиях небольших минусовых температур – до -5 –8°С. Известно, что хотя температура плавления льда равна 0°С, чистая вода, охлажденная до более низких температур, не всегда замерзает, продолжая оставаться в жидком состоянии (эффект переохлаждения воды). Небольшие объемы абсолютно чистой воды могут оставаться в состоянии переохлаждения вплоть до температур порядка -40°С. Формирование льда в такой переохлажденной жидкости начинается при внесении в нее веществ, могущих служить центрами (зародышами) образования льда. Например, кристаллы йодистого серебра, широко применяемого метеорологами для борьбы с градом, вызывают образование льда при температурах от -5 до - 8°С, тогда как большая часть органических частиц природного происхождения служат центрами кристаллизации льда лишь при температурах -10°С. В природных условиях, характеризующихся присутствием большого количества потенциальных центров кристаллизации, формирование кристаллов льда в жидкости начинается при температурах не намного ниже 0°С. Как показали исследования последних лет, существенный фактор повреждения многих растений ранними заморозками – эпифитная и сапрофитная микрофлора. Механизм явления связан с тем, что клетки данных микроорганизмов способны синтезировать определенный белок, локализующийся во внешней мембране этих бактерий и являющийся превосходным центром кристаллизации льда уже при температурах -1,5–1,8°С. Перечисленные бактерии, главным образом широко распространенные сапрофитные микроорганизмы видов, образуют поверхностный белок, служащий зародышем для формирования кристаллов льда (БФКЛ). БФКЛ, вызывающий формирование кристаллов льда в различных частях растений (листья, стебли, корни), собственно, и является одним из главных факторов, ответственных за повреждение тканей чувствительных растений при ранних заморозках. Многочисленные эксперименты в строго контролируемых условиях показали, что стерильные растения не повреждались заморозками вплоть до температур порядка -6–8°С, тогда как у растений, имеющих соответствующую микрофлору, повреждения возникали уже при температурах -1,5–2°С. Мутанты этих бактерий, потерявшие способность синтезировать БФКЛ, формировали обычную сапрофитную микрофлору растений, которая, однако, не повышала температуру формирования кристаллов льда. В результате растения с такой мутантной микрофлорой, не синтезирующей БФКЛ, были устойчивы к заморозкам в условиях, когда растения с естественной микрофлорой повреждались при понижении температуры. БФКЛ в естественных условиях связан с поверхностью бактери- альных клеток, центром кристаллизации льда, по существу, является сама бактериальная клетка. Однако в эксперименте нанесение этого белка на поверхность стерильных растений давало такой же эффект повреждения тканей при температуре около -2°С. Более тщательные исследования показали, что наряду с БФКЛ определенную роль могут играть также высокомолекулярные полисахариды и липиды бактериального происхождения, но их вклад в повреждение растений ранними заморозками в природных условиях, очевидно, невелик. В основе генно-инженерного подхода к борьбе с повреждающим действием ранних заморозков лежит тот факт, что БФКЛ мутанты как природные, так и экспериментально полученные, теряют способность повреждать сельскохозяйственные растения (цитрусовые, томаты, картофель) при низких температурах. Поэтому возникла идея получить стабильные БФКЛ мутанты названных бактерий, неспособные к реверсии к дикому БФКЛ+ типу, и вытеснить с их помощью природную микрофлору, синтезирующую БФКЛ. Наиболее простой путь для достижения этой цели – идентификация гена, кодирующего БФКЛ, его клонирование и локализация местоположения в бактериальной хромосоме, что открывает возможность для полного делетирования. Именно такой подход был реализован практически одновременно несколькими авторскими коллективами. Гены БФКЛ были клонированы из клеток, и для них определена полная нуклеотидная последовательность. Экспрессия этих генов в рекомбинантных клетках Е. со1i придавала им способность функционировать в качестве центра кристал- лизации льда, причем повышение температуры замерзания воды было пропорционально количеству синтезированного клетками БФКЛ. Во фрагменте ДНК, программировавшем синтез БФКЛ, была обнаружена открытая рамка считывания, соответствовавшая полипептиду с молекулярной массой 118 кД (1200 аминокислотных остатков). Последовательность аминокислот, реконструированная на основе данных нуклеотидной последовательности, обнаружила характерные структурные мотивы, основанные на существовании 122 несовершенных повторов октопептида. Эти повторы придают белку БФКЛ периодичность высокого порядка, которая по теоретическим соображениям должна быть присуща потенциальному кристаллизатору льда, способному упорядочивать молекулы воды в растворе. Делетирование этих повторов из молекулы БФКЛ приводило к потере льдообразующей способности у оставшейся части молекулы. Полевые эксперименты, проводившиеся с многими природными штаммами бактерий, неспособными служить центрами кристаллизации льда, показали, что они могут успешно конкурировать со штаммами, синтезирующими БФКЛ, понижая их концентрацию в 10 – 1000 раз на зерновых, картофеле, цитрусовых, ягодных кустарниках, деревьях и других культиварах. Поскольку основным недостатком многих природных БФКЛ штаммов является легкая возможность реверсии к дикому БФКЛ+ типу или неполное выключение синтеза этого белка, особые надежды возлагаются на рекомбинантные БФКЛ клетки, из которых ген этого белка полностью делетирован. Следует также указать, что наряду с описанным генно-инженерным подходом некоторые авторы пытаются решить проблему элиминации БФКЛ+ микрофлоры с помощью фагов, лизирующих соответствующие штаммы бактерий. Однако рассмотрение этой чисто микробиологической методики лежит за пределами предмета нашего изложения. Можно надеяться, что в ближайшее время эти БФКЛ бактерии, созданные с помощью методов генной инженерии и рассчитанные на использование в качестве компонента внешней среды, будут широко испытаны в полевых условиях и послужат основой для создания нового биотехнологического метода борьбы с заморозками.

Контрольные вопросы 1. Какие три уровня выделяют в генной инженерии? 2. Какие этапы включает клонирование генов? 3. Каким образом можно получить нужный ген? 4. В чем заключается метод получения генов с помощью ревертаз? 5. Что такое химико-ферментативный синтез генов? 6. Каким образом осуществляется передача генетической информации в клетку-реципиент? 7. Что такое «плазмида» и амплификация? 8. В чем суть механизмов: трансформации, трансфекции и трансдукции? 9. Какие существуют перспективы использования методов генной инженерии?