Гормононезависимые растительные ткани

Каллусные клетки в пересадочной культуре при длительном культивировании могут спонтанно приобрести способность к росту на среде без гормонов. т. е. становятся автономными по отношению к ауксинам и цитокининам. Природа такой независимости к одному или к обоим стимуляторам роста, обычно применяемым при получении и выращивании клеточных культур растений, может быть генетической (результат мутации) или эпигенетической (результат экспрессии генов, определяющих независимость клетки от экзогенных регуляторов. Такие клетки называются «привыкшими». «Привык- шие» ткани, как и опухолевые, в большинстве случаев не способны к нормальной регенерации и образуют лишь тератомы, хотя, по некоторым данным, из них в отдельных случаях получаются нормальные регенеранты. Следует отметить, что у всех каллусных тканей в процессе культивирования заметно снижается, а затем и полностью утрачивается способность к регенерации. Из старых пересадочных культур получить растения-регенеранты не удается. Возможно, «привыкание» связано с длительным действием на клетки гормонов, поддерживающих их в дедифференцированном или активно пролиферирующем состоянии. Кроме «привыкших» тканей, представляющих собой химические опухоли, существуют опухоли растительного происхождения, вызванные бактериями, вирусами, а также генетические опухоли, возникающие на межвидовых гибридах различных растений. Наибо- лее распространенными в природе и представляющими наибольший интерес для исследователей являются корончатые галлы-опухоли, индуцированные у двудольных растений агробактериями (Аgrobacterium tumefaciens). Часто встречаются еще два вида истинных опухолей у растений — бородатый корень (заболевание, вызываемое А. rhizodenes) и стеблевой галл, вызываемый А. rubi, сходный с корончатым галлом. Общим свойством «привыкших» и опухолевых растительных тканей является их гормононезависимость, т. е. способность расти на средах без гормонов. Это основное их отличие от каллусных тканей, для которых присутствие гормонов в питательной среде является не- обходимым условием дедифференцировки и пролиферации клеток. В «привыкших» тканях, так же как и в опухолевых, идет интенсивный синтез собственных гормонов, поэтому они не нуждаются во внесении их в питательные среды. Внешне гормононезависимые ткани не отличаются от каллусных, и основным их отличием является приобретение способности к интенсивному синтезу гормонов. Это свойство является общим как для «привыкших», так и для опухолевых клеток. Только в опухолевых тканях синтез гормонов связан с переносом в растительную клетку бактериального гена, отвечающего за этот процесс. А у «привыкших» тканей гормононезависимость достигается в результате изменения активности генов, отвечающих за синтез ферментных белков, участвующих в построении молекул гормонов, т. е. отвечающих за синтез гормонов. Таким образом, изменения в данном случае имеют эпигеномный характер. Подавляющее большинство «привыкших» клеток теряет способность к регенерации. В 40-х годах XX в. Браун, ученик Ф. Уайта, показал, что культура ткани корончатогалловой опухоли даже в отсутствии агробактерий, например, после гибели их под воздействием повышенной температуры, сохраняет опухолевые свойства. На искусственной питательной среде без гормонов ткань корончатого галла, лишенная бактерий, продолжала интенсивно пролиферировать. Ткани корончатых галлов содержат более высокие уровни ауксинов, чем нормальные, и продуцируют несколько цитокининов. На основании своих опытов Браун пришел к выводу, что растительные клетки какимто образом трансформируются (превращаются) в опухолевые после воздействия агробактерий. Было выдвинуто предположение, что агробактерии вводят в клетки растения фактор Tip, который за 36 часов превращает нор- мальные клетки в опухолевые. В дальнейшем оказалось, что Тiр представляет собой ДНК и находится в большой плазмиде агробактерии (Ti-плазмида). Онкогенная активность может быть утрачена в результате удаления из бактериальной клетки всей Тi-плазмиды или ее определенной части. В дальнейшем было установлено, что опухоли корончатого галла возникают в результате включения определенного фрагмента Тi- плазмиды агробактерии в растительную ядерную ДНК. Таким образом, сегмент Тi-плазмиды (Т-ДНК) интегрируется в хромосому и становится частью наследственного аппарата трансформированной (опухолевой) растительной клетки. Интеграция Т-ДНК Тi-плазмиды агробактерии в хромосому растения приводит к появлению опухоли и гормононезависимому росту опухолевых клеток на искусственных питательных средах. Оба эти явления тесно связаны друг с другом, так как именно гормононезависимость, являющаяся следствием экспрессии генов, контролирующих синтез ауксинов и цитокининов, приводит к де- дифференцировке и пролиферации клеток. Тi-плазмида является природным вектором (переносчиком) новых генов в растения. Путь синтеза ауксинов и цитокининов клетками опухолей, индуцированных агробактериями, иной, чем у нормальных и «привыкших» клеток. Он более простой и короткий. Установ- лено, что не один локус, а ряд генов ответвечают за опухолевый рост. Кроме ауксинов и цитокининов Т-ДНК детерминирует синтез опинов. Эти вещества не являются причиной возникновения опухолей. Они синтезируются в уже образовавшейся опухолевой ткани. Опины — производные аминокислот, различных кетокислот и cахаров. Они являются биологически активными соединениями нового типа, обна- руживаемыми только в тканях корончатых галлов у растений, поэтому их можно рассматривать как биохимические маркеры для клеток корончатых галлов. Опины служат питательным веществом для агробактерии, однако опухоли продолжают продуцировать эти соединения и в стерильных культурах, не содержащих агробактерии. Извест- но три типа опинов: нопалин, октопин и агропин. Кроме гомононезависимости общим свойством «привыкших» и индуцированных агробактериями опухолевых тканей является потеря ими способности регенерировать фертильные растения. «Привыкшие» ткани обычно не регенерируют нормальных растений, их клетки утрачивают способность ко вторичной дифференцировке и морф генезу. Однако в некоторых случаях, варьируя составы питательных сред, удается отодвинуть порог «привыкания». Галловые опухоли в подавляющем большинстве случаев также не способны к регенерации нормального растения. Иногда они образуют тератомы – уродливые органоподобные структуры, которые не могут развиваться нормально

 

 

Суспензионные культуры

Суспензионными культурами называют культуры клеток растений, выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой питательной среде. Суспензию клеток можно получить из каллуса, поместив его в колбу в жидкую питательную среду с автоматическим перемешива- нием. Скорость перемешивания для получения первичной суспензии на круговой качалке – 100–120 об/мин. Для получения 100 мл клеточной суспензии необходимо 2–3 г свежей каллусной ткани. Суспензии лучше образуются из рыхлых, обводненных каллусных тканей, чем из структурированных плотных каллусов. Исключение из питательной среды ионов кальция, а также обработка транспланта, предназначенного для выращивания в суспензионной культуре, пектиназой, которая разрушает пектат кальция, склеивающий отдельные клетки, значительно облегчают суспендирование. Суспензионную культуру можно получить и прямо из фрагмента органа растения (диски запасающей паренхимы корнеплодов моркови, петрушки, клубней картофеля и др.). Однако такой путь более трудный и длительный. Клетки экспланта должны образовать первичный каллус, и только после этого поверхностные каллусные клетки, попавшие в жидкую среду и размножившиеся в ней, дадут начало линии, способной расти в суспензии. Первичную суспензию перед субкультивированием фильтруют через 1—2 слоя марли, нейлоновые или металлические сита, чтобы избавиться от крупных, плотных кусков каллусной ткани (или остатков экспланта) и очень крупных агрегатов. Фильтрование рекомендуется и в нескольких последующих субкультивированиях до приобре- тения клеточной суспензией желательных характеристик. Качество суспензии обусловлено степенью ее агрегированности (агрегаты не должны содержать более 10–12 клеток), морфологической выравненностью клеток (небольшие размеры, сферическая или слегка овальная форма, плотная цитоплазма), отсутствием трахеидоподобных элементов.

Необходимым условием культивирования клеточных суспензий является постоянное перемешивание или встряхивание среды. Если клеточная суспензия находится в неподвижном состоянии, то это приводит к образованию каллусной ткани. Деление суспензионных клеток поддерживается при наличии ауксинов и цитокининов, т. е. тех гормонов, которые необходимы для индукции и роста каллусных клеток. Таким образом, суспензионные культуры представлены типичными каллусными клетками, обладающими всеми свойствами, характерными для клеток такого рода. Хорошо растущая суспензия имеет S-образную кривую роста. Обычно длительность пассажа составляет 14–16 дней. Суспензия для субкультивирования берется в конце экспоненциальной фазы. Часть суспензионной культуры, используемая для пересадки в свежую среду, называется инокулюм. Соотношение продолжительности отдельных фаз ростовой кривой зависит: от генетической характеристики популяции клеток, т. е. от вида растения, взятого для суспензионной культуры; от количества инокулюма, взятого для субкультивирования. Учеными из г.Кельна при изучении поглощения питательных веществ клеточными суспензиями культур кукурузы, ячменя и риса установлено, что оптимальным, обеспечивающим нормальный рост суспензии, является соотношением массы клеток к питательной среде 1:27, а минимальным – 1:10); от условий выращивания (состава среды, температуры, начального значения рН, состава газовой фазы, скорости перемешивания). Основными критериями роста суспензионных культур служат увеличение числа клеток, их сырой и сухой массы. Для работы с клеточными суспензиями необходимо знать жизнеспособность, плотность, степень агрегированности и скорость роста клеток в суспензионной культуре. Жизнеспособность клеток определяют по их окрашиванию красителем (метиленовая синь или синь Эванса). Живые клетки не окрашиваются красителем вследствие не- проницаемости для него клеточных мембран. В мертвые клетки краска легко проникает, и они окрашиваются в синий цвет. Плотность клеточной популяции определяют в счетной камере под микроскопом после мацерации (разделения клеток) 10–20 %-й хромовой кислотой. Клеточные суспензии в биотехнологии используются для получения вторичных метаболитов, многие из которых являются ценными лекарственными препаратами, для промышленного выращивания клеточной биомассы и для клеточной селекции. Наряду с этим, суспензии клеток можно применять в качестве исходного материала для получения изолированных протопластов. Суспензионные культуры растительных клеток имеют целый ряд преимуществ перед традиционными методами производства продуктов природного происхождения на растительной основе. Прежде всего, это- экономия посевных площадей;

-независимость от болезней, вредителей и капризов погоды;

-программируемость, тесная взаимосвязь между спросом и предложением;

-стабильность поставок.

При использовании суспензионных культур в качестве продуцентов вторичных веществ применяют закрытые или открытые системы ферментеров в периодическом или проточном режимах выращивания клеток. В закрытой системе клеточная суспензия лишена притока свежей питательной среды до конца выращивания, а в случае непрерывного режима выращивания в открытой системе питательная среда меняется на свежую. Как при периодическом, так и при проточном режимах выращивания в открытой системе клетки остаются в питательной среде и не удаляются даже при ее замене. В открытых системах культивирования при замене питательной среды (периодическом или непрерывном) вместе со средой отбирается и часть суспензионных клеток. Для промышленного получения продуктов вторичного синтеза из больших клеточных масс используют ферментеры емкостью от 20000 и более литров, в которых проводят непрерывное культивирование клеток. Наиболее распространенным режимом глубинного культивирования клеточных суспензий является закрытая периодическая система. Вследствие культивирования вне организма отмечается генетическая изменчивость клеток, исчезают одни и появляются другие стойкие эпигенетические изменения, передающиеся в ряду клеточных поколений. Адаптивный отбор, идущий в популяциях, приводит к возникновению из первичной каллусной ткани генетически и фенотипически различающихся линий клеток. Это позволяет отобрать и экспериментально создать линии, синтезирующие принципиально новые вещества. В суспензионных культурах обнаружены традиционные для исходных растений продукты вторичного метаболизма, а также в них выявлены новые необычные соединения, например, кам птотецин, харрингтонин и другие антиканцерогены, пептиды (ингибитор протеаз, ингибитор фитовирусов) и др. Это дает возможность использовать суспензионные культуры для получения важных продуктов, применяемых в медицине, пищевой и парфюмерной промышленности, защите растений.

Следует отметить, что деление клеток, приводящее к увеличению клеточной биомассы, и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Синтез вторичных метаболитов достигает максимума в стационарной фазе роста.