Препараты азотфиксирующих микроорганизмов

 

Азот является элементом, в первую очередь определяющим величину урожая. В растениях он входит в состав белков, хлорофилла, аминокислот, амидов, алкалоидов и других веществ. Потребность в азоте у растений особенно велика в период уси- ленного развития листовой поверхности, т. е. в первый период роста растений. Поступает азот в растение главным образом в виде минеральных соединений: нитратов и аммонийных солей (аниона N0₃ и катиона NH₄). Эти соединения поступают в почву в процессе минерализации органического вещества, с минеральными удобрениями и осадками, включающими соединения азота, которые появились в атмосфере в результате грозовых разрядов, промышленных выбросов и извержений вулканов. Основным источником пополнения азотного фонда почв является биологическая фиксация молекулярного азота атмосферы, который находится в недоступной для растений форме. Фиксацию молекулярного азота в биосфере нашей планеты осуществляют только определенные виды микроорганизмов, которые обладают ферментом нитрогеназой, способной восстанавливать молекулу азота до аммиака. Процесс биологической фиксации азота не требует материальных затрат, не вызывает загрязнения природной среды и обладает ря- дом других преимуществ перед минеральными удобрениями, что побуждает все страны вести поиск и разработку новых приемов активизации этого процесса. Одним из таких приемов является нитрагинизация бобовых.

 

Нитрагин. Первым из бактериальных удобрений начали применять нитрагин – препарат, содержащий культуру клубеньковых бактерий. Мысль об использовании для улучшения образования клубеньков и снабжения бобовых молекулярным азотом возникла вскоре после того, как М. Бейеринк в 1888 г. выделил клубеньковые бактерии (ризобии) в чистую культуру. Клубеньковые бактерии – своеобразные микроорганизмы, особенности биологии которых сформировались под влиянием почвы при сапрофитном способе жизни и растений – при симбиотрофном существовании. Будучи аэробными гетеротрофными микроорганизмами, клубеньковые бактерии хорошо развиваются как на природных, так и на полностью синтетических бактериологических средах. По скорости роста на питательных средах клубеньковые бактерии делят на две группы — быстрорастущие и медленнорастущие. Первые имеют среднее время генерации 2–4 ч, вторые – 6–8 ч. Поскольку клубеньковые бактерии обладают строгой специфичностью и заражают лишь определенные бобовые растения, препараты их готовят для каждого вида бобовых растений. Впервые препарат клубеньковых бактерий под названием «нитрагин» был изготовлен в 1896 г. в Германии. В России первые опыты по нитрагинизации провели в начале двадцатого столетия. Применять нитрагин целесообразно тогда, когда в данной местности вводятся новые культуры бобовых и в составе данной флоры нет перекрестно заражающихся с ними растений. Подобная обстановка имела место при введении сои в новых зонах ее возделывания. В таких случаях на естественное заражение и образование клубеньков нельзя рассчитывать, так как в почвах данных районов эти виды клубеньковых бактерий практически отсутствовали. Гораздо труднее решить вопрос о старопахотных, хорошо окультуренных почвах, на которых издавна выращивают определенные виды бобовых растений, в таких почвах сложились в достаточной степени многочисленные и стабильные популяции клубеньковых бактерий культивируемых бобовых растений. Нужна ли здесь искусственная инокуляция и оправдает ли она себя? Массовые опыты, про- веденные под руководством академика Е. Н. Мишустина, в целом позволяют положительно ответить на поставленный вопрос. Это основывается на ряде причин.

Bo-первых, на старопахотных почвах нередко происходит пере- крестное заражение, т. е. бобовые инокулируют клубеньковые бактерии близких групп растений. В таких случаях клубеньки образуются,но функционируют они неполноценно. Применение нитрагина обеспечивает инокуляцию бобового растения активной расой клубеньковых бактерий.

Во-вторых, в почвах, не занятых бобовыми растениями, клубеньковые бактерии существуют как обычные сапрофиты. Иногда в силу ряда причин почва оказывается неблагоприятной средой для клубеньковых бактерий. Их численность существенно уменьшается, а активность снижается. В подобных случаях естественная инокуляция не обеспечивает эффективного симбиоза и здесь также целесообразно применять нитрагин. Установить целесообразность использования инокуляции для определенных площадей можно лишь проведя соответствующие исследования распространения и эффективности клубеньковых бактерий в определенных почвенно-климатических условиях. В условиях сменяющихся периодов избыточного увлажнения и высыхания почвы сохранению клубеньковых бактерий в значительной мере способствуют почвенные коллоиды. Выживание при иссушении почвы выше в глинистых и органогенных почвах по сравнению с почвами более легкого механического состава. Быстрорастущие виды клубеньковых бактерий более чувствительны к высушиванию, чем медленнорастущие. Азотные удобрения, по нашим исследованиям, воздействуют на клубеньковые бактерии почвы главным образом через растение. Корни бобовых растений, обеспеченных связанным азотом, выделяют меньше редуцирующих сахаров и других веществ, стимулирующих рост ризобий. Ухудшение пищевого режима в ризосфере удобренных бобовых растений ведет к снижению количества клубеньковых бактерий в почве. На численность клубеньковых бактерий в почве оказывают отрицательное влияние хищные простейшие, микобактерии, микробы- антагонисты, ризобиофаги, а также межвидовой и внутривидовой антагонизм. Сохранению и стабилизации ризобиальной популяции способствуют почвенные микроорганизмы с выраженной гидролитической активностью. Эти микроорганизмы способствуют выживанию популяции клубеньковых бактерий, если их численность не превышает 1 млн клеток в 1 г почвы. При этом клубеньковые бактерии как олиготрофные микроорганизмы функционируют в рамках микрофлоры рассеяния в круговороте углерода. Особенности естественной инокуляции бобовых клубеньковыми бактериями. Примерно в 50% сельскохозяйственных угодий популяции клубеньковых бактерий представлены малоэффективными расами по сравнению с теми, на которых в настоящее время производят нитрагин. Эти бактерии не обеспечивают высокую эффективность естественной инокуляции, вследствие чего бобовые растения не выполняют в полной мере функцию азотонакопителей и значитель- ную долю азота берут из почвы. Здесь можно надеяться на положительный результат применения нитрагина. На почвах с высокоэффективными расами клубеньковых бактерий на успешность нитрагинизации можно рассчитывать лишь тогда, когда препараты будут изго- товляться на штаммах, превосходящих по эффективности местные расы. Данные количественного и качественного изучения почвенной популяции клубеньковых бактерий являются надежным критерием необходимости искусственного заражения бобовых. Но поскольку такие исследования довольно сложны и трудоемки, то в практике можно воспользоваться результатами определения наличия и состояния клубеньков на корнях у растений, уже имеющихся на участке либо высеянных с инокуляцией, Клубеньки, образованные эффективными штаммами или малоэффективными штаммами клубеньковых бактерий, часто различаются внешним видом. Эффективные клубеньки обычно крупные, розовые, даже красноватые, благодаря наличию в них леггемоглобина, гладкие и плотные, при благоприятных условиях часто гроздевидные. Расположены такие клубеньки в основном на главном корне и в верхней (базальной) части боковых корней. Малоэффективные клубеньки обычно многочисленны, мелкие, белые, зеленоватые, бурые или желтые, часто сморщенные, расположены по всей корневой системе растения, преимущественно на боковых корнях. При анализе таких данных следует обратить особое внимание на действие различных внеш- них факторов, которые могут ограничить развитие и функционирование клубеньков (протравливание семян, кислотность почвы, высокий уровень почвенного азота и т. п.) и недоучет которых приведет к неверным практическим выводам. В сомнительных случаях следует проводить искусственное заражение. При этом важно учитывать некоторые общие положения и типичные примеры инокуляции отдельных видов бобовых культур. Люцерна в большинстве случаев хорошо отзывается на инокуляцию, если под нее отводят почвы дерново-подзолистые и другие типы кислых почв, в которых клубеньковые бактерии отсутствуют или встречаются в незначительном количестве благодаря спорадическому распространению дикорастущего донника. Качественная инокуляция люцерны дает высокий эффект. Однако внедрение клубеньковых бактерий люцерны в микробные ценозы кислых почв без их известкования и улучшения других агрохимических и водно- физических свойств идет сравнительно трудно. Клевер на пахотных почвах, как правило, образует много клубеньков и менее отзывчив на инокуляцию по сравнению с люцерной. Обусловлено это длительным его выращиванием, которое привело к формированию мощной естественной популяции Rh. trifolii в большинстве разновидностей клеверопригодных почв. Однако в некоторых почвах клубеньковые бактерии имеются в недостаточном количестве и инокуляция клевера дает хорошие результаты. Проведенные нами опыты свидетельствуют о целесообразности нитрагинизации клевера, особенно в сочетании с применением микроэлементов. Перспективной следует считать инокуляцию клевера на мелиорированных торфяно-болотных почвах как в чистых посевах, так и в травосмесях при залужении. Немаловажное значение имеет подбор для производства нитрагина высокоактивных штаммов ризобий, хорошо адаптированных к возделываемым сортам клевера и почвенным условиям. Успешная инокуляция клевера, проводимая на больших площадях в Англии, Голландии, Австралии и других странах, является убедительным примером высокой эффективности данного приема, когда его применяют с максимальным учетом конкретных условий. Искусственное заражение бобовых культур клубеньковыми бактериями широко применяется в Англии, США, Южной Америке, Австралии, Индии, Швеции и других странах. Выпускаемые технические препараты нитрагина по физическому состоянию можно подразделить на жидкие, или бульонные; плотные, или агаровые; сыпучие, в виде лиофильно высушенной бактериальной массы или соответствующего вещества – носителя культуры бактерий. В качестве носителей используют почву, торф, бентонит, тальк, древесный уголь и другие вещества по отдельности или в различных сочетаниях. Для приготовления качественного нитрагина используют наиболее активные штаммы клубеньковых бактерий, способные, с одной стороны, образовывать достаточное количество клубеньков и обеспечивать высокий уровень азотфиксации при низких энергетических за- тратах, с другой — противостоять конкуренции местной популяции ризобий и почвенной микрофлоры не только в присутствии растения- хозяина, но и без него. Нитрагин обычно готовят на одном штамме соответствующего вида ризобий, но возможно приготовление и полиштаммовых препаратов. В отношении эффективности последних нет однозначных результатов и в связи с этим в нашей стране такие формы нитрагина пока не готовят. Выбор формы нитрагина зависит от общей потребности в препарате, условий технологии, наличия подходящего носителя, требований недопустимости посторонней микрофлоры, продолжительности сохранности клубеньковых бактерий в препарате, на семенах, применения протравителей семян. Для изготовления нитрагина с наименьшим содержанием посторонней микрофлоры измельченный торф подвергают радиационной (γ-излучение) или тепловой стерилизации. Расфасованный в полиэтиленовые пакеты или другие емкости торф инокулируют инъекцией жидкой культуры клубеньковых бактерий. Содержимое герметизированных пакетов перемешивается, выдерживается несколько дней при температуре 18–20°С и затем хранится при температуре не ниже -30 °С и не выше 10 °С. Наиболее подходит для производства нитрагина торф высокой степени разложения, имеющий близкую к нейтральному значению реакцию. Качественный торф является хорошим носителем ризобий и широко применяется в производстве нитрагина. Недостатком торфа является трудность его тепловой стерилизации и сравнительно малая адгезивность к оболочкам семян бобовых, что не всегда позволяет обеспечить достаточную дозу инокулюма. Культура клубеньковых бактерий, внесенная в торф, развивается быстро. Ризоторфин содержит в начале хранения не менее 1 млрд/г клеток медленнорастущих и не менее 2 млрд/г клеток быстрорастущих клубеньковых бактерий. Хранение торфяного нитрагина сопровождается гибелью клубеньковых бактерий, интенсивность которой зависит от ряда фак- торов и определяет годность препарата. Весьма важной причиной низкого качества и даже полной непригодности препарата является обильное развитие в нем посторонней микрофлоры. К концу гарантийного 6-месячного срока хранения ризоторфина допускается снижение количества медленнорастущих клубеньковых бактерий до 0,3 млрд/г, быстрорастущих – до 0,5 млрд/г. Производят в нашей стране и сухой нитрагин (ризобин), технология производства которого разработана ВНИИ бакпрепаратов. В 1г ризобина содержится 3 млрд/г клеток медленнорастущих, 5 млрд/г быстрорастущих клубеньковых бактерий. Гарантийный срок хранения 6 месяцев. К концу срока хранения препарата количество медленнорастущих клубеньковых бактерий снижается в среднем до 1 млрд/г, быстрорастущих–1,5 млрд/г. Вследствие значительной вариабельности размножения и выживания клубеньковых бактерий в нитрагине необходима проверка их качества. Выбор способа инокуляции бобовых растений зависит от физического состояния и качества нитрагина, наличия соответствующих машин и установок, необходимости протравливания семян, продолжительности хранения инокулированных семян и других условий. Основным требованием в выборе способа является обеспечение такого количества жизнеспособных клубеньковых бактерий, которые, находясь на высеянном семени или будучи внесенными непосредственно в почву, в состоянии обеспечить максимальное образование клубеньков на растении-хозяине. Доля клубеньков, образованных вносимыми штаммами, может колебаться от 5 до 50% и даже от 0 до 100% в зависимости от свойств бактерий и метода инокуляции. Прибавка урожая при инокуляции активными штаммами происходит только в случае, если внесенные штаммы образуют не менее 30% клубеньков. Самым простым способом нитрагинизации является опудривание семян сухим лиофилизированным торфяным или любым другим сыпучим препаратом, но вследствие плохого приставания препарата к семенам этот способ дает неудовлетворительные результаты. Повышение эффекта достигается при предварительном нанесении на семена клеящих веществ в виде 2,5%-го раствора латекса, 40%-го раствора гуммиарабика или других прилипателей, предохраняющих инокулированные семена от осыпания нитрагина. Опыливание торфяным нитрагином, по нашим данным, может быть применено для предпосевной обработки протравленных фунгицидами семян и гранулированного суперфосфата, вносимого в почву одновременно с высевае- мыми семенами, так как торф в некоторой мере защищает часть клеток ризобий от непосредственного контакта с химикатами и тем самым сохраняет их жизнеспособность. Смачивание семян бактериальной суспензией является простым и наиболее распространенным способом заражения их клубеньковы- ми бактериями. Для этого используются бульонный, агаровый и сухие препараты нитрагина в соответствующем разведении. При смачивании следует избегать избытка жидкости, затрудняющей хранение и высев набухших семян. Этот прием позволяет повысить дозу инокулянта, но после высыхания семян последний в основной массе осыпается, если не использован какой-либо прилипатель. Ризоторфин применяют для предпосевной обработки семян из расчета 200 г препарата на одну гектарную норму высева семян. При ручной обработке семена равномерно смачивают водой (1,5–2% воды от массы обрабатываемых семян) и сразу же прибавляют к ним нужное количество ризоторфина и перемешивают. Обработанные ризоторфином семена должны быть высеяны в тот же день во влажную почву. Для повышения выживаемости клубеньковых бактерий, допускающей так называемую заблаговременную инокуляцию, прибегают к дражированию семян. Дражирование в наиболее простом варианте заключается в том, что влажные семена опыливают хорошо измельченным мелом, а инокулируют их влажным, но не мокрым лиофилизированным торфяным или почвенным нитрагином накануне или во время высева. Если инокуляция производится некачественно, она приводит к гибели клубеньковых бактерий и заражению обработанных семян грибами. Необходимо совершенствовать способы инокуляции. Совершенный способ предварительной централизованной нитрагинизации семян бобовых более отвечает условиям специализированного сельскохозяйственного производства нашей страны. Особого внимания заслуживают методы заражения бобовых культур эффективными штаммами клубеньковых бактерий через почву. Один из методов состоит в том, что гранулы пористых носителей торфа, гипса, пемзы, пропитанные суспензией клубеньковых бактерий, высеваются вместе с семенами. Второй способ заключается в раздельном внесении суспензии клубеньковых бактерий и семян в почву; при этом сеялка дополняется специальным устройством для подачи инокулянта к высеянным семенам. Преимуществами данных способов прединокуляции является то, что они сводят до минимума контакт клубеньковых бактерий- инокулянтов с токсичной оболочкой семян, протравителями, удобрениями и конкуренцию с местной популяцией ризобий. Оба способа требуют определенных усовершенствований. В частности, необходимо сократить массу гектарной порции гранулированного нитрагина с 30–50 кг до 3–5 кг без существенного сокращения общего количества клеток инокулюма, создать простые, универсальные устройства для внесения жидкого инокулянта в почву одновременно с высевом семян. Азотобактерин. Помимо клубеньковых бактерий и азотфиксирующих эндофитов клубеньков небобовых растений в почве обитает большое количество так называемых свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов, связывающих молекулярный азот вне контакта с клетками корня. Для инокуляции почв применяются свободноживущие азотфиксаторы разных видов, обладающие нитрогеназной активностью. Из всех этих микроорганизмов определенный интерес представляет азотобактер, являющийся основой бактериального удобрения – азотобактерина. Известно несколько видов азотобактера, но наибольшее практическое значение имеет Az. chroococcum. Азотобактер чрезвычайно требователен к реакции среды. Наи- больший урожай клеток он дает при рН 6,5–6,7. В отношении температуры азотобактер является типичным мезофильным организмом. Оптимальной для его развития считается температура 25–30 °С. Культуры азотобактера образуют значительное количество биологически активных веществ, среди которых прежде всего следует отметить витамины группы В, никотиновую, пантотеновую кислоты, биотин, гетероауксин и гиббереллин. Е.Н. Мишустиным с соавторами было показано, что некоторые культуры азотобактера выделяют фунгистатические вещества с широким спектром действия. В отношении бактерий и актиномицетов эти вещества не действуют. Распространен азотобактер в разных почвах. Однако следует отметить, что этот микроб является очень требовательным организмом к среде обитания. Поэтому наличие и степень развития его в почве в каждом конкретном случае зависит от комплекса условий, из которых наибольшее значение имеют кислотность почвы, ее гидротермический режим, аэрация, оптимальное содержание подвижных элементов питания, микроэлементов, а также доступных источников углерода и т. д. Способность азотобактера размножаться при соответствующих условиях в ризосфере сельскохозяйственных культур дала основание предположить, что этот микроорганизм может улучшать азотное пи- тание растений. По предложению академика С.П. Костычева и его со- трудников с 30-х годов начали применять землеудобрительный препарат, содержащий культуру Az. chroococcum. Выпускают несколько видов азотобактерина. Агаровый азотобактерин представляет собой культуру азото- бактера, выращенную в бутылках или культуральных сосудах на агаровой среде. На поверхности агара после инкубирования при 25–27 °С в течение 4–6 дней образуется беловатая слизь, которая со временем приобретает темно-коричневую окраску. В бутылках, содержащих до 40 млрд клеток азотобактера, агаровый нитрагин рассылали на места. Для обработки семян на 1 га зерновых культур расходовали 2 бутылки азотобактера, для картофеля и овощных культур – 3–4 бутылки. Производство агарового азотобактерина сопряжено с рядом существенных недостатков: трудность механизации производственных процессов; быстрое снижение количества жизнеспособных клеток и вследствие этого малый срок годности препарата — 3 месяца; потребность в большом количестве бутылок; плохая транспортабельность, поскольку азотобактерин боится низких температур. В силу указанных недостатков агаровый нитрагин выпускался в ограниченном количестве.