Получение трансгенных растений с улучшенными качествам

Рассмотрим этапы генно-инженерных манипуляций, приводящих к получению трансгенных растений с улучшенным аминокислотным составом белка. Эта работа включает ряд этапов:

1) клонирование генов запасных белков;

2) изучение механизмов тканеспецифичной временной экспрессии белков и определение последовательностей ДНК, определяющих данный механизм;

3) целенаправленное изменение последовательности генов запасных белков с целью улучшения аминокислотного состава;

4) создание векторов, содержащих измененный ген;

5) введение модифицированных генов в растения.

Получение трансгенных растений с улучшенными качествами невозможно без огромного подготовительного этапа, включающего детальное изучение как всего гена; так и его элементов, участвующих в регуляции синтеза белка. На сегодняшний день охарактеризованы десятки генов запасных белков злаков, бобовых и ряда других растений, изучены структура и свойства этих генов. Общий план изолирования генов запасных белков включает следующие этапы: 1) получение и частичную очистку соответствующей РНК;

2) синтез и клонирование ДНК; 3) изолирование из геномных библиотек последовательности гена конкретного запасного белка.

В настоящее время клонировано 10 генов гордеинов ячменя, гены α- и β-глиадинов и глютенина пшеницы, зеинов кукурузы, легумина бобовых, пататина картофеля и ряд других. При этом следует отметить, что для некоторых из генов определена даже нуклеотидная последовательность. Дальнейшее исследование генов запасных белков показало общность строения этих генов, что представляется логичным, так как они выполняют одинаковую функцию. Так, общим для подавляющего большинства генов запасных белков является отсутствие интронов. Кроме того, у них на расстоянии 300 н. п. от точки начала транскрипции расположена специфическая последовательность в 25 н. п., названная эндоспермбоксом. Синтез запасных белков имеет жесткую регуляцию: гены экспрессируются только в единственной ткани (проламины злаков только в эндосперме зерна) и в течение короткого периода развития зерна. Чем же это достигается? Для изучения механизма тканеспецифической и временной экспрессии генов используют так называемый делиционный анализ, который предполагает вырезание различных фрагментов гена с тем, чтобы определить значимость того или иного фрагмента для функционирования целого гена. Так, методом делиционного анализа было показано, что именно 25-нуклеотидная последовательность эндосперм-бокса стимулирует экспрессию генов запасных белков в эндосперме зерна. Более того, было показано, что продукт любого гена, перед которым находится последовательность эндоснерм-бокса, синтезируется только в семенах или зернах. Таким образом, было определено значение этой 25- нуклеотидной последовательности для синтеза запасных белков, так- же необходимость включения ее в состав трансформационных векторов, содержащих модифицированную последовательность генов проламиновых белков с целью их последующего депонирования в семенах или зернах. Рассмотрим следующий этап в получении трансгенных растений с улучшенным аминокислотным составом белка на примере модифицированного азеина кукурузы. Дополнительные кодоны в последовательность гена вводили с помощью олигонуклеотид направленного мутагенеза. Впервые такая работа была проведена по введению кодонов лизина в последовательность гена и как раз на гене α-зеина. Теперь такое введение новых триплетов является довольно обычным. После модификации нуклеотидной последовательности α-зеина следовало соединение всех частей в вектор для трансформации. Это осуществлялось с использованием рестриктаз, вырезающих необходимые фрагменты гена, в нашем случае модифицированного гена α- зеина, из клона геномной библиотеки и промотора, в данном случае это промотор β-фазолинового гена. Кроме того, в состав конструкции входила последовательность эндосперм-бокса. Соединение этих фрагментов ДНК и клонирование в вектор происходило с использованием ДНК-лигазы. Кроме того, в состав вектора должен входить ген-маркер, по которому будет вестись селекция. В наиболее часто используемых конструкциях таким маркерным геном является ген KmR, определяющий устойчивость к антибиотику канамицину. Наличие маркерного гена необходимо для того, чтобы на ранних стадиях можно было отобрать только те растения, в геном которых был интегрирован вектор, так как невозможно отличить на стадии каллуса или ранних этапов регенерации трансформированные растения от нетрансформированных. Если трансформацию проводят с помощью агробактерии, то выбираются векторные системы на основе Тi-плазмиды и интересующий нас ген вместе с геном-маркером встраивается в область Т-ДНК. Таким образом, в Т-ДНК область вектора входит модифицированная последовательность гена а-зеина с промоторной областью, маркерный ген KmR, определяющий устойчивость к канамицину, и повторы правой и левой границы, фланкирующие Т-ДНК. Векторную конструкцию вводят в клетки агробактерии. Трансформация растительных клеток табака происходит при культивировании фрагментов листа табака и агробактерии, в результате чего происходит встраивание векторной конструкци с модифицированным геном зеина в отдельные клетки мезофилла листа. Затем фрагменты листьев табака переносятся на среду для регенерации. Введение в состав среды для регенерации растений-трансформантов антибиотика канамицина приводит к выживанию только те растения, геном которых содержит векторную последовательность модифицированного гена запасного белка и гена-маркера. Полученные растения-трансформанты, отобранные на селективной среде с антибиотиком, анализируют на присутствие векторной конструкции методом блот-гибридизации и определяют уровень экспрессии модифицированного белка. Таким образом, были получены растения табака, трансформированные геном модифицированного а-зеина кукурузы, обогащенного лизином. Модифицированный белок активно синтезировался в семенах, трансформированы этим вектором растений кукурузы, с получением линий кукурузы с улучшенным качеством зерна. В дальнейшем такие трансгенные линии могут использоваться при выведении новых сортов методами классической селекции. Эксперимент по трансформации пшеницы геном высокомолекулярной субъединицы белка глютенина с измененной последовательностью показал, что введение в геном растения модифицированного гена проламина приводит к активному синтез модифицированного белка и влияет на состав и уровень соответствующих запасных белков, что, в конечном итоге, привело к улучшению хлебопекарного качества пшеничной муки. Одним из новых подходов к улучшению состава белков является конструирование химерных генов на основе генов запасных белков однодольных и двудольных. В качестве исходных генов были ис- пользованы ген гордеина В1 ячменя и легумина В4 бобов. Конструкцией, содержащей такой химерный ген, были протрансформированы растения табака и получены трансгенные линии. Таким образом, становится реальной возможность манипулирования белковым составом эндосперма зерновых методами генетической инженерии.

Геннная инженерия растений

Поиски путей введения чужеродных генов в клетки высших растений интенсивно ведутся во всем мире с начала 70-х годов. Одним из импульсов к развитию методов переноса чужеродных генов в растения стали результаты детального изучения молекулярно- генетических основ опухолевого роста у растений при участии бактерий рода Agrobacterium. В результате этих исследований оказалось, что опухолеобразующие плазмиды агробактерий (Ti – tumor inducing, индуцирующая опухоль), представляющие собой мини-кольцевые ДНК, являются природной векторной системой, которую сейчас ис- пользуют для переноса генов в растения. Плазмида агробактерии переносит часть своей ДНК в ДНК растительной клетки, в ДНК встраивается «нужный» ген. С помощью этого уникального вектора уже получено большое число трансгенных растений. Важно также то, что методы генной инженерии сейчас используют не только в практике, это важнейшая методология для познания фундаментальных основ организации и функционирования растительного генома. Генетическая инженерия – это система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных (гибридных) молекул ДНК. Суть генетической инженерии сводится к переносу в растения чужеродных генов, которые могут сообщать растениям полезные свойства. Такие манипуляции осуществляются с помощью соответствующих ферментов – рестрикционных эндонуклеаз, расщепляющих молекулы ДНК в строго определенных участках, и лигаз, сшивающих фрагменты в единую рекомбинантную молекулу ДНК. И так, процедуры генетической инженерии сводятся к тому, что из набора фрагментов ДНК, содержащих нужный ген, собирают гибридную структуру, которую затем вводят в клетку. Введенная генетическая информация экспрессируется, что приводит к синтезу нового продукта. Таким образом, вводя в клетку новую генетическую информацию в виде гибридных молекул ДНК, можно получить измененный организм. Растения имеют одно очень важное преимущество перед животными, а именно возможна их регенерация in vitro из не дифференцированных соматических тканей с получением нормаль- ных, фертильных (способных завязывать семена) растений. Это свойство (тотипотентность) открывает для молекулярных биологов большие возможности в изучении функционирования генов, введенных в растения, а также используется в селекции растений. Для конструирования растений необходимо решить следующие задачи: выделить конкретный ген, разработать методы, обеспечивающие включение его в наследственный аппарат растительной клетки, регенерировать из единичных клеток нормальное растение с измененным генотипом.

Таким образом, методология генетической инженерии в отношении растений направлена на коренное изменение методов традиционной селекции с тем, чтобы желаемые признаки растений можно было получать путем прямого введения в них соответствующих генов вместо длительной работы по скрещиваниям. Формально датой рождения генетической инженерии растений является полученное с помощью Ti-плазмидного вектора первое в мире химерное растение санбин (sunbeen) как результат переноса гена запасного белка бобовых (фазеолина) в геном подсолнечника (sunflower + been). Это было первым ощутимым, хотя, быть может, и несовершенным свидетельством того, что в отношении растений генетическая инженерия сможет оправдать надежды специалистов в области молекулярной генетики, биологии и селекции. Оперонная регуляция. В 1961 году Ф. Жакоб и Ж. Моно на основании генетического и биохимического изучения усвоения лактозы клетками E.coli К12 предложили гипотезу о регуляции активности генов у бактерий, получившую мировую известность как «модель оперона». Один или несколько структурных генов вместе с прилегающими к ним регуляторными участками образуют элементарную единицу транскрипции – оперон. Совокупность всех регуляторных участков, определяющих эффективность транскрипции, часто называют регуляторной областью или промоторной зоной. Согласно опе- ронной модели, на хромосоме имеется, по крайней мере, четыре компонента системы регуляции: структурный ген (или гены, контролирующие связанные биохимические функции), ген-регулятор, оператор и промотор, которые составляют оперон.Огромную роль в регуляции транскрипции играют белки- регуляторы. Обычно это лишенные каталитической активности алло- стерические белки, способные взаимодействовать с низкомолекулярными эффекторами и контролировать выражение определенных опе- ронов. Белки-регуляторы связываются с нуклеотидами промоторной зоны, которые предшествуют промотору или перекрываются с ним и активируют или подавляют транскрипцию. Ген-регулятор (R) определяет структуру белка репрессора. Этот белок способен связываться с оператором (D), который контролирует функционирование прилежащих структурных генов (a, b, c). Промотор (P) является начальным участком для связывания РНК- полимеразы – фермента, который катализирует транскрипцию ДНК в РНК. Если белок-репрессор связан с оператором, то РНК- полимераза не может перемещаться или присоединяться к промотору), и РНК, которые комплементарны последовательности генов a, b, c, не образуются. Следовательно, соответствующие ферменты также не синтезируются. Когда оператор свободен от белка репрессора, то фермент РНК- полимераза, присоединившись к промотору Р, может перемещаться и транскрибировать гены a, b, и c. Образование индуцибельных ферментов происходит при добавлении индуктора, который связывается с белком-репрессором и инактивирует его. Первым из исследованных был оперон, контролирующий метаболизм лактозы (lac-оперон). Он образован генами lac Z, lac Y, lac А, которые соответственно определяют синтез -галактозы, галактозидпермеазы и ацетилтрансферазы.

Ф. Жакоб и Ж. Моно предположили, что репрессор представляет собой аллостерический белок, содержащий два специфических центра. Один из них обладает сродством к нуклеотидной последовательности оператора, а другой – к молекуле индуктора. Присоединение индуктора к репрессору снижает сродство первого аллостерического центра к оператору, в результате чего освобождает оператор от репрессора. Мутации в гене-регуляторе или операторе могут нарушить образование репрессора или его связывание. В обоих случаях потребность в индукторе для синтеза белка исчезает. Такие мутации называются конститутивными, поскольку у них соответствующие белки- ферменты начинают синтезироваться постоянно. Получение конститутивных мутантов имеет важное значение в селекции промышленных штаммов микроорганизмов. Связывание РНК-полимеразы с ДНК может происходить и в отсутствии субстратов – нуклеозидтрифосфатов (НТФ). В определен ных условиях фермент образует прочные комплексы с промоторными участками, расположенными в начале оперона. Узнавание промоторов возможно лишь при наличии в составе РНК-полимеразы S-фактора, белка с молекулярной массой 70 000 Д, который играет каталитическую роль в этом процессе. Поскольку сам S-фактор не связывается с ДНК, он действует, по-видимому, как ал- лостерический эффектор, изменяя конформацию минимального фермента, в результате чего он приобретает способность узнавать промоторы и связываться с ними. После инициации и присоединения нескольких нуклеотидов S-фактор отделяется от РНК-полимеразы. Образовав открытый комплекс с ДНК, РНК-полимераза способна инициировать цепь РНК за счет соединения двух нуклеотидтри- фосфатов (НТФ), при этом первые НТФ – АТФ, ГТФ или редко ЦТФ входят в состав цепи целиком. Прекращение синтеза РНК происходит в результате появления терминирующего сигнала, информация о котором записана в структуре ДНК. Предполагается, что РНК, синтезированная на концевых участках оперонов, способна образовывать специфическую вторич- ную структуру, так называемую терминаторную шпильку, с участием которой происходит отсоединение от ДНК.

II. Клонирование генов.

Современную биотехнологию нередко характеризуют как биотехнологию на основе генетической инженерии. Действительно, это основной путь, используемый для направленной модификации биообъектов в результате введения искусственно созданных генетических программ. Иногда различают три уровня генетической инженерии: генную – прямое манипулирование рекомбинантными ДНК, включающими отдельные гены; хромосомную – манипуляции с большими группами генов или целыми хромосомами; геномную – перенос всего или большей части генетического материала от одной клетки к другой.

В современном понимании генетическая инженерия включает технологию рекомбинантных ДНК. Метод рекомбинации in vitro заключается в выделении ДНК из разных видов, получении гибридных молекул ДНК и введении рекомбинантных молекул в живые клетки с тем, чтобы добиться проявления нового признака, например, синтез специфического белка. Что касается двух других уровней генетических манипуляций, то геномная инженерия соответствует тому, что ныне принято обозначать как клеточная инженерия. Трансплантация хромосом и их фрагментов играет пока второстепенную роль как метод модификации биообъектов. Помимо этого, различать хромосомную и геномную инженерию можно было бы лишь в применении к эукариотам, у про- кариот понятия «хромосома» и «геном» часто совпадают. Работы в области генетической инженерии включают четыре основных этапа: получение нужного гена; его встраивание в генетический элемент (вектор), способный к репликации; введение гена, входящего в состав вектора, в организм- реципиент; идентификация (скрининг и селекция клеток, которые приобрели желаемый ген (гены). Рассмотрим по отдельности каждый этап.

III. ПОЛУЧЕНИЕ ГЕНОВ.

Клонирование генов – это процедура, включающая выделение, амплификацию отдельных генов в реципиентных клетках про- и эукариот. Получить нужный ген можно: а) выделением его из ДНК; б) путем химико-ферментативного синтеза; в) созданием на основе изолированной матричной РНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы).

Выделение генов из ДНК. Изолированную ДНК подвергают фрагментации. Для этого используют рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы), катализирующие расщепление ДНК на участках, имеющих определенные последовательности нуклеотидов (обычно длиной в 4–7 нуклеотидных пар).

К настоящему времени известно более 400 рестриктаз, которые узнают 85 различных нуклеотидных последовательностей. Расщепление может происходить по середине узнаваемого участка нуклеотидных пар, и тогда обе нити ДНК «разрезаются» на одном уровне. Образующиеся фрагменты имеют двунитевые (тупые) концы. Другие рестриктазы расщепляют нити ДНК со сдвигом, так что образуется ступенька – одна из нитей ДНК выступает на несколько нуклеотидов. Образуются однонитевые (липкие) концы. Участки уз- навания ДНК многими рестриктазами обладают симметрией второго порядка. И еще одна очень важная особенность разрыва, генерируемого в ДНК рестриктазами: образующиеся на концах однотяжевые последовательности ДНК комплементарны друг другу. При необходимости тупые концы могут быть превращены в липкие. Для этого к тупым концам присоединяют двуцепочечные последовательности (линкеры) с участками узнавания рестриктазы, дающей липкие концы. Нуклеотидная последовательность с липкими концами может быть присоединена к вектору, предварительно обра- ботанному той же рестриктазой, или превращена из линейной молекулы в кольцевую путем сшивания взаимно комплементарных концов. Если встречаются два липких фрагмента ДНК, полученных действием одной и той же рестриктазы, то в силу комплементарности концевых последовательностей они легко вступают во взаимодействие.

Метод выделения генов из ДНК с помощью рестриктаз имеет существенные недостатки. Трудно подобрать рестриктазы, позволяющие вырезать из ДНК именно тот участок, который соответствует нужному гену. Наряду с интересующим геном фрагменты ДНК, как правило, включают лишние нуклеотидные последовательности, создающие помехи для использования генов. Рестриктаза может отщепить часть нуклеотидной последовательности гена, в результате чего ген теряет функциональную полноценность. Гены эукариотных организмов имеют сложное строение: включают кодирующий белок, значащие (экзоны) и промежуточные, незначащие участки (интроны). Первичная РНК, синтезированная на такой ДНК-матрице, подвергается модификации (сплайсингу), в результате чего участки, соответствующие интронам, удаляются, а участки, соответствующие экзонам, соединяясь, образуют зрелую матричную РНК. Наличие интронов является препятствием для нормального функционирования трансплантированных генов. При обработке ДНК рестриктазами образуется смесь фрагментов. Непростая задача выделить из этой смеси именно те фрагменты, которые несут нужный ген. Бактериальная клетка содержит около 5 тыс. генов, а эукариотная клетка – от 10 до 200 тыс.

Химико-ферментативный синтез генов. Этот метод – важная альтернатива «вырезанию» генов с помощью рестриктаз из ДНК. Метод включает химический синтез коротких (8–16-звенных) одноцепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного образования эфирных связей между нуклеотидами и сшивку олигонуклеотидов между собой посредством ДНК-лигазы с образованием двухцепочечных полинуклеотидов. Структурный ген ДНК интрон интрон интрон экзон экзон экзон экзон транскрипция. Первичный транскрипт РНК сплайсинг Матричная РНК. Химико-ферментативный синтез позволяет точно воссоздать минимально необходимую последовательность нуклеотидов и избежать проблем, связанных с элиминированием лишних нуклеотидных последовательностей в фрагментах ДНК, в том числе интронов. Кроме того, имеется возможность введения в гены участков узнавания различных рестриктаз, регуляторных последовательностей и т. д. Для химико-ферментативного синтеза генов необходима полная информация о его нуклеотидной последовательности, поэтому применимость метода ограничена возможностями получения такой информации. Последовательность нуклеотидов в гене может быть воссоздана на основе первичной структуры соответствующего белка. Триумф в анализе структуры гена – параллельное воссоздание нуклеотидной последовательности ДНК и цепочки аминокислотных остатков в кодируемом белке. Методом химико-ферментативного синтеза получены гены соматостатина, А- и В-цепей инсулина, проинсулина, lac-оператор E.coli и др.

Ферментативный синтез генов на основе выделенной из клетки матричной РНК. Это наиболее популярный метод синтеза генов. Обратная транскриптаза (ревертаза) катализирует синтез нити ДНК, комплементарной РНК. Полученную одноцепочечную ДНК, называемую комплементарной ДНК или кДНК, используют в качестве матрицы для синтеза второй нити ДНК с применением ДНК-полимеразы или ревертазы. Преимущество рассматриваемого метода состоит в том, что ген получается без интронов и других нетранскрибируемых последовательностей. Помимо этого, легче создать условия, когда клетка аккумулирует нужный вид мРНК, чем отбирать ген из смеси фрагментов ДНК. Большим успехом в применении метода, основанного на РНК зависимом синтезе ДНК, является получение в 1979 г. гена гормона роста человека (соматотропина).

IV Введение гена в вектор.

Ген, полученный тем или иным способом, содержит информацию о структуре белка, но сам по себе не может реализовать эту информацию. Нужны дополнительные механизмы, управляющие действием гена, поэтому перенос генетической информации в клетку осуществляется в составе векторов. Век- торы – это, как правило, кольцевые молекулы, способные к самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором образует рекомбинантную ДНК. Конструирование рекомбинантных ДНК осуществляется in vitro. Кольцевая молекула вектора размыкается рестриктазой. Необходимо, чтобы полученная линейная молекула ДНК содержала липкие концы, комплементарные концам вводимой ДНК. Комплементарные липкие концы вектора и вводимого гена сшивают ДНК-лигазой и полученную рекомбинантную ДНК с помощью той же ДНК-лигазы вновь замыкают с образованием единой кольцевой молекулы. Если эндонуклеазы действуют без образования липких концов, их получают следующим образом. На конце векторной молекулы (в виде линейной ДНК) с помощью специального фермента – терминальной (концевой) нуклеотидтрансферазы – наращивают короткие полинуклеотидные последовательности, состоящие из одного и того же нуклеотида – аденина полиаденин (поли-А). Концы фрагментов ДНК, содержащих искомый ген, наращивают способом политимин (поли-Т) комплементарен полиаденин-А. Далее, объединив вектор с фрагментами, получают рекомбинантную ДНК, сшив вектор и фрагмент ДНК-лигазой.

Метод имеет определенные недостатки: фрагмент гена получают случайным образом. Различают два основных класса векторов: вирусы и плазмиды. Важной проблемой, возникающей при использовании вирусов в качестве генетических векторов, является их аттеньюация - ослабление патогенности для хозяина, чтобы зараженные вирусом клетки выживали и могли передать потомству измененную генетическую программу. Большое значение для биотехнологии имеет способность вирусов быстро транспортироваться из клетки в клетку, распространяясь по растительной или животной ткани так, что в короткие сроки развивается генерализованная инфекция по всему организму. Такое свойство вирусов открывает возможность генетической модификации соматических клеток взрослого организма. В этом отношении открываются перспективы лечения наследственных заболеваний человека путем введения вирусов, разносящих недостающие гены по всем клеткам человеческого тела. Получение рекомбинантной ДНК с помощью терминальной нуклеотидтрансферазы

Плазмиды – автономные самореплицирующиеся генетические единицы, найдены у бактерий, грибов, растений и животных. Наибольшее применение в генетической инженерии нашли бактериальные плазмиды, особенно плазмиды E.coli. Бактериальные плазмиды подразделяются на коньюгативные, т. е. способные к переносу генетической информации от клетки к клетке путем коньюгации бактерий, и неконьюгативные, передающиеся от одной клетки к другой посредством механизма бактериальной трансформации. Перенос неконьюгативных плазмид путем коньюгации возможен только в том случае, если имеется плазмида- помощник, способная к самостоятельному транспорту. Некоторые плазмиды способны к амплификации, т. е. образуют в клетке большое число копий, что резко повышает уровень фенотипического выраже- ния генов. При конструировании векторов исследователь вводит в него участки узнавания рестриктаз, а также маркеры, кодирующие легко распознаваемые признаки. По этим признакам можно отобрать клетки, являющиеся носителями вектора. Большой интерес представляют космиды, в состав которых введен cos-участок ДНК фага E.coli, отвечающий за упаковку ДНК в фаговую частицу. Такие плазмиды способны передавать очень большой объем генетической информации (до 10 тыс. пар азотистых оснований), рекомбинантные ДНК могут быть упакованы в фаговые частицы.

V. Перенос генов в клетки организма-реципиента.

Передача генов, встроенных в плазмиду, осуществляется путем трансформа- ции, коньюгации, трансфекции и т.д. Если гены встраиваются в геном вируса, наиболее распространенным способом передачи информации служит трансформация. Трансформация – это перенос свободной ДНК, в том числе и плазмидной, в реципиентную клетку, вызывающий изменение признаков клетки. При этом происходят рекомбинация и интегрирование однонитевого фрагмента ДНК в хромосому реципиента или какую- либо внехромосомную генетическую единицу. Трансформацию может вызывать ДНК бактерий, впервые это наблюдал Гриффит у пневмококков в 1926 году. Проникновение ДНК в клетку бактерий требует ее компетентного, т. е. восприимчивого, состояния. У представителей Streptococcus и Pneumococcus выделены и очищены факторы компетентности – белки с молекулярной массой 5–10 мД. Компетентность клетки определяется также условиями внешней среды. У E.coli и B.subtilis эффективная трансформация достигается обработкой клеток CaCl2 и полиэтиленгликолем (ПЭГ). Генетический материал, проникающий в клетку, может быть атакован внутриклеточными нуклеазами. В этой связи успешной трансформации способствует: подавление активности или синтеза нуклеаз (трансформация клеток E.coli с высокой эффективностью была проведена при использовании мутантов, дефектных по нуклеазам); включение трансформирующей ДНК в липосомы – искусственные мембранные липидные везикулы. Для проведения трансформации растений и грибов, в частности дрожжей, необходимо получение интактных протопластов. При трансформации протопластов дрожжей с помощью химерных плазмид, сочетавших плазмиду CoLEI E.coli и ген LEU2 дрожжей, в присутствии ПЭГ и CaCl2 клетки приобрели способность синтезировать лейцин. Аналогичным способом получены дрожжи, устойчивые к антибиотику тетрациклину. Ti- и Ri-плазмиды Rhizobium и Agrobacterium трансплантируются в протопласты растительных клеток путем трансформации. Совместное культивирование протопластов растений (петунии) и Agrobacterium tumifaciens ведет к необычно высокоэф- фективной трансформации растительных клеток. Клетки растений могут быть трансформированы генетическим материалом вирусов при включении в фосфатидилсеринхолестериновые липосомы в присутствии ПЭГ и CaCl2.

Трансформация представляет собой наиболее универсальный путь передачи генетической информации. Она имеет наибольшее значение для генетической инженерии. Коньюгацию и трансфекцию можно рассматривать как варианты трансформации, осложненной наличием специальных приспособлений для эффективного переноса генов. Путем коньюгации происходит перенос лишь некоторых плазмид (коньюгативных). В этом случае информация перекочевывает из одной клетки бактерии (мужской, донорной) в другую клетку (женскую, реципиентную) по половым ворсинкам, представляющим собой белковые трубочки. Хотя круг плазмид, самостоятельно осуществ- ляющих коньюгативный перенос, ограничен, неконьюгативные плазмиды также могут передаваться путем коньюгации при участии плазмид-помощников.

Под трансфекцией понимают передачу всего набора генов вируса или фага, приводящую к развитию вирусных частиц в клетке. В генетической инженерии методика проведения трансфекции включает в приложении к бактериям очистку среды инкубации от внеклеточных нуклеаз и добавление очищенной ДНК того или иного фага в сочетании с протаминсульфатом, значительно повышающим эффективность трансфекции. Трансфекция клеток растений и животных соответствующими векторами вирусной природы может быть проведена как при использовании очищенной ДНК и протопластов, так и при заражении целых многоклеточных организмов (в этом случае чаще говорят не о трансфекции, а об инфекции) вирусными частицами или их ДНК. В последние годы сконструированы многочисленные челночные векторы, способные к репликации в животной и бактериальной клетках и поддерживающие эффективный синтез клонируемого гена в животной клетке. Трансдукция – перенос ДНК от клеток к клеткам фагами и плазмидами. Попадая в клетку бактерии, фаг интегрирует с ее хромосомой и после размножения и разрушения клетки хозяина выходит из нее, унося с собой фрагменты хромосомы бактерии. Они невелики и колеблются в пределах 1–2 % ДНК бактерии. Такой фаг, попадая в новую бактериальную клетку, вновь встраивается в ее хромосому, и приносит в нее новый фрагмент в качестве дополнительного генетического материала. ДНК этого фрагмента совместно с фаговой вступает во взаимодействие с хромосомой нового хозяина и путем двойного кроссинговера интегрирует с ней. Не все клетки, зараженные фагом, гибнут. Если трансформируемая фагом клетка выживает и делится, то это равносильно появлению нового штамма бактерий, поскольку они несут новый ген и новый признак. При переходе фагов от доноров к реципиенту лишь в немногих случаях наблюдается трансдукция. В большинстве же внесенные фрагменты чужой ДНК разрушаются ферментами нуклеазами. Бывают случаи, когда фаги не интегрируют с хромосомой реципиента и не убивают ее. Клетка делится, и в одну из ее дочерних форм попадает ранее присутствующий в ней фаг. Здесь он может интегрировать и проявить захваченный им блок генов в признаке, т. е. экспрессия генов наступает через одно или даже несколько поколений. Такая трансдукция называется абортивной. Существуют фаги и вирусы, которые не имеют постоянного участка прикрепления к хромосоме хозяина. Такие фаги встраиваются в разные фрагменты ДНК, которые затем переносятся в клетки реципиентного штамма. Такая трансдукция называется неспецифической или общей.

Трансгеноз – это искусственный перенос генов из одной биосистемы в другую с целью получения новых форм организмов, имеющих новые признаки.

 

VI. Идентификация клеток-реципиентов, которые приобрели желаемый ген (гены). После трансформации, коньюгации или трансфекции необходимо идентифицировать клетки, несущие ген- мишень. Успех генноинженерного проекта часто зависит от эффективности использования метода отбора. Значение этого этапа генноинженерной разработки становится очевидным, если учесть тот факт, что после трансплантации генов, как правило, лишь небольшая часть клеток содержит необходимый ген. Отбор клеток проводят в две стадии. Первая стадия – отбор клеток, несущих соответствующий вектор, послуживший для трансплантации гена. Чаще всего такой отбор проводится по генетическим маркерам, которыми помечен вектор. Так, детерминанты устойчивости к антибиотикам на векторе позволяют обогатить бактериальную популяцию клетками, содержащими этот вектор, при их высеве на среду с антибиотиками.

Вторая стадия – поиск клеток, несущих не только вектор, но и ген-мишень. Для этого используют две группы методов. Первая группа методов основана на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов: а) определение нуклеотидной последовательности ДНК; из клеток, предположительно содержащих искомый ген, выделяют ДНК вектора, в которой проводится поиск участков, несущих этот ген; затем проводят секвенирование (как правило, части) нуклеотидной последовательности гена; б) гибридизация выделенной из клеток ДНК с зондом, который может быть или интересующим нас геном, или соответствующей ему мРНК. Предварительно изолированную ДНК переводят в одноцепочечное состояние и вводят ее во взаимодействие с одноцепочечным ДНК- (или РНК-) зондом. Далее определяют присутствие двуцепочечных гибридных молекул ДНК.

Вторая группа методов основана на индентификации признака, кодируемого геном: а) непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок – продукт транскрипции и трансляции гена-мишени, или клеток, образующих соединение, в синтезе которого участвуют ферменты, кодируемые геном (так отбирали дрожжи, синтезирующие гистидин из популяции клеток, трансформированных смесью химерных плазмид); б) селективные среды, поддерживающие рост только тех клеток, которые получили ген-мишень (например, клетки-реципиенты, несущие ген -галактозидазы (фермент, необходимый для утилизации лактозы) – могут быть отобраны путем выращивания бактериальных клеток на среде с лактозой в качестве единственного источника углерода; в) иммунологическая детекция: применяется, если искомый ген в составе рекомбинантной ДНК транскрибируется и транслируется, но никак не влияет на фенотип организма (например, если ген кодирует -интерферон человека, бактериальные клетки лизируют, а затем проводят реакцию связывания антигена с антителами к - интерферону). Иногда возникает необходимость идентификации гена до встраивания в вектор или в составе вектора, но вне клеток- реципиентов. В этом случае используют бесклеточную систему сопряженной транскрипции-трансляции и с помощью специфических антител идентифицируют ген по его белковому продукту.