Этапы и методы клонального микроразмножения растений.

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на четыре этапа: 1) выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры; 2) собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества мериклонов; 3) укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+ 2°, + 10°С); 4) выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Существует много методов клонального микроразмножения. Различные авторы, проводя индивидуальные исследования по влиянию условий культивирования эксплантов на процессы морфогенеза, наблюдали разные ответные морфогенетические реакции на изменение условий выращивания, что в свою очередь привело к созданию новых классификаций методов клонального микроразмноженя. Исходя из предложенных в литературе методов микроразмножения растений, этот процесс возможно осуществлять следующими путями: активация развития уже существующих в растении мери- стем (апекс стебля, пазушные и спящие почки и интеркамерные зоны стебля); индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта; индукция соматического эмбриогенеза; дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной тканях. Основной метод, используемый при клональном микроразмножении растений, – это активация развития уже существующих в растении меристем, основывающийся на снятии апикального доминирования. Это может быть достигнуто двумя путями: а) удалением верхушечной меристемы стебля и последующим микрочеренкованием побега in vitro на безгормональной среде; б) добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6- фурфурилами-нопурин (кинетин), а также 2-изопентениладенин (2ip) и зеатин.

Полученные таким образом побеги отделяют от первичного материнского экспланта и вновь культивирует на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков. В настоящее время этот метод широко используется в производстве безвирусного посадочного материала сельскохозяйственных культур как технических (сахарная свекла, хмель, табак, топинамбур, стахис), так и овощных (томаты, картофель, огурец, перец, тыква, спаржа и др.); а также для размножения культур промышленного цветоводства (гвоздика, хризантема, роза, гербера), тропических и субтропических растений (рододендрон, азалия, камелия, чай и др.), плодовых и ягодных культур (яблоня, слива, вишня, груша, виноград, малина, смородина, крыжовник и др.) и древесных растений (тополь, ива, ольха, береза, рябина, секвойя, туя, можжевельник и др.). Для некоторых сельскохозяйственных культур, таких, как картофель, технология клонального микроразмножения поставлена на промышленную основу. Применение метода активации развития существующих в растении меристем позволяет получать из одной меристемы картофеля более 105 растений в год, причем технология предусматривает получение в пробирках микроклубней – ценного, безвирусного семенного материала.

Второй метод –это индукция возникновения адвентивных по чек непосредственно тканями экспланта. Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и, таким образом, регенерировать целые растения.

Образования адвентивных почек можно добиться почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковицы, сегментов корней и зачатков соцветий), если их удается полу- чить свободными от инфекции. Этот процесс, как правило, происходит на питательных средах, содержащих один цитокинин или в сочетании с ауксином, находящихся в соотношении 10:1 или 100: 1. В качестве ауксина в этом случае наиболее часто используют индолил- 3-уксусную кислоту (ИУК) или нафтил-уксусную кислоту (НУК). Это наиболее распространенный метод микроразмножения высших растений, которым были размножены многие луковичные цветочные растения (нарциссы, лилии, гиацинт, гладиолусы, тюльпаны) из луковичных чешуи, сегментов базальной части донца луковиц, эксплантов листьев; представители рода Brassica. Достаточно хорошо разработана технология клонального микроразмножения земляники, основанная на культивировании апикальных меристем. Меристематические верхушки изолируют из молодых тканей. Несомненный интерес у исследователей вызывает вопрос, связанный с происхождением адвентивных почек, и, в частности, какие клеточные слои участвуют в дифференциации меристем. Единого мнения по этому вопросу пока нет. Так, Тран Тан Ван в своих работах с тканями табака показала, что именно эпидермис является наи- более активной тканью, способной образовывать почки, каллус или корни в зависимости от гормонального баланса питательной среды. Цитологические исследования, проведенные на сегментах базальной части донца луковиц тюльпанов и нарциссов, показали, что адвентивные побеги формируются из поверхностных слоев меристематических клеток, прилегающих к донцу, а для растений глоксинии процесс формирования адвентивных почек, как правило, происходит в субэпидермальных клеточных слоях листовых пластинок. Единого мнения по этому вопросу также нет и среди исследователей, рабо- тающих с древесными растениями. Так, было показано, что образование почек на изолированной хвое ели обыкновенной происходит в эпидермальном слое культивируемого экспланта, для псевдотсуги – в субэпидермальных слоях, а при культивировании семядолей сосны замечательной на среде, содержащей один цитокинин (БАП), этот процесс происходит одновременно как в эпидермальном, так и в субэпидермальном слоях. Для сосны обыкновенной также было отмечено образование адвентивных почек в эпидермальном и субэпидермальном слоях семядолей зародыша, и этот процесс для сосны не за- висит от применяемых цитокининов.

Третий метод, практикуемый при клональном микроразмножении, основывается на дифференциации из соматических клеток заро- дышеподобных структур, которые по своему внешнему виду напоминают зиготические зародыши. Этот метод получил название — соматический эмбриогенез. Основное отличие образования зародышей in vitro от in vivo (в естественных условиях) заключается в том, что соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биополярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня.

Согласно Стеварду, соматические зародыши проходят три стадии развития: глобулярную, сердцевидную, торпедовидную и в конечном итоге имеют тенденцию к развитию в проросток. Это явление впервые было отмечено в культуре клеток моркови еще в середине 50-х годов XX в., а в настоящее время используется для размножения большинства растений из семейства Orchidaceae и Rutaceae, некоторых представителей злаковых (пшеница, ячмень), люцерны, редиса, винограда, а также некоторых видов древесных пород (осина, эвкалипт, дуб, ель обыкновенная). Соматический эмбриогенез возможно наблюдать непосредственно в тканях первичного экспланта, а также в каллусной культуре. Причем последний способ менее пригодный при клональном микро- размножении, так как посадочный материал, полученный таким методом, будет генетически нестабилен по отношению к растению- донору. Как правило, соматический эмбриогенез происходит при культивировании каллусных клеток в жидкой питательной среде (суспензия) и является наиболее трудоемкой операцией, так как не всегда удается реализовывать свойственную клеткам тотипотентность. Однако этот метод размножения имеет свои преимущества, связанные с сокращением последнего (третьего) этапа клонального микроразмножения, не требующего подбора специальных условий укоренения и адаптации пробирочных растений, так как соматические зародыши представляют собой полностью сформированные растеньица. При использовании соответствующей техники их капсулирования из этих эмбриоидов возможно получать искусственные семена. Четвертый метод клонального микроразмножения — дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани. Он мало используется для получения посадочного материала in vitro. Это связано с тем, что при периодическом пересаживании каллусной ткани на свежую питательную среду часто наблюдаются явления, нежелательные при микроразмножении: изменение плоидности культивируемых клеток, структурные перестройки хро- мосом и накопление генных мутаций, потеря морфогенетического потенциала культивируемыми клетками Наряду с генетическими изменениями растений наблюдаются и морфологические: низкорослость, неправильное жилкование листьев и их расположение по стеблю, образование укороченных, утолщенных междоузлий, уродливость, пониженная устойчивость к болезням и вредителям. Причем длительное культивирование каллусных клеток усугубляет эти изме- нения, поэтому период неорганизованного роста при микроразмножении должен быть сведен к минимуму. Однако, несмотря на некоторые недостатки, данный метод имеет положительные стороны и преимущества.

Во-первых, он является эффективным и экономически выгодным, так как в процессе размножения из каждой индивидуальной каллусной клетки при благоприятных условиях культивирования может сформироваться адвентивная почка, дающая начало новому растению.

Во-вторых, в ряде случаев он является единственно возможным способом размножения растений в культуре тканей.

В-третьих, представляет большой интерес для селекционеров, так как растения, полученные данным методом, различаются генетически и морфофизиологически. Это дает возможность селекционерам проводить отбор растений по хозяйственно важным признакам и оценивать их поведение в полевых условиях. Этот метод целесообразно применять лишь к тем растениям, для которых показана генетическая стабильность каллусной ткани, а вариа- бельность между растениями-регенерантами не превышает уровня естественной изменчивости. К таким растениям можно отнести амариллис, томаты, спаржу, некоторые древесные породы и другие культуры. Через каллусную культуру были размножены сахарная свекла, некоторые представители рода Brassica, кукуруза, рис, пшеница и другие злаковые, подсолнечник, лен, разработаны условия, способствующие регенерации растений из каллуса огурца, картофеля, томатов.