Улучшение аминокислотного состава белков злаковых и некоторых других культур методами инженерии белков

 

Важная потенциальная область применения генно-инженерных подходов в растениеводстве – улучшение качества зерна основных злаковых культур, прежде всего изменение аминокислотного состава запасных белков. Как известно, в запасном белке большей части злаковых имеется дефицит лизина и в меньшей степени треонина, что заметно снижает их пищевую и кормовую ценность. Введение в эти белки дополнительных количеств дефицитных аминокислот могло бы ликвидировать аминокислотный дисбаланс. Поскольку большая часть генов запасных белков важнейших злаковых культур клонирована и в значительной мере секвенирована, то наиболее перспективно применение сайт-специфического мутагенеза, а также инженерии белков. Основная сложность проблемы состоит в том, что изменение аминокислотного состава белка может повлечь за собой изменение его физико-химических свойств, ухудшение качества и снижение урожайности. В ряде случаев методами традиционной селекции удавалось существенно повысить содержание в запасных белках злаковых лизина, но такие культивары не получили распространения ввиду заметного ухудшения урожайности.

Более подробно эта проблема рассмотрена в связи с вопросом о структуре запасных белков. Наибольшее значение для сельского хозяйства в целом имеет улучшение пищевых и фуражных свойств зерна путем повышения содержания лизина и треонина. В настоящее время преодоление дефицита этих незаменимых аминокислот в корме свиней и птицы обеспечивается в значительной мере добавлением продуктов микробиологического синтеза белка, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК. Для этой цели в ряде стран сконструированы рекомбинантные микроорганизмы, синтезирующие большие количества лизина, треонина и других аминокислот в свободном виде. Такие добавки приводят к значительному экономическому эффекту. При увеличении содержания треонина с 3,0 и лизина с 3,6 г на 100 г фуража в корме свиней путем введения соответствующих добавок до 4,8 и 7,5 г соответственно суточный прирост массы у поросят увеличивался с 0,32 до 0,64 кг, т. е. практически вдвое. При этом важно отметить, что затраты единицы корма снижаются на 40 % – с 5 до 3,2 г на 1 г прироста массы. Сходные результаты получены также и с птицами. Пул свободных аминокислот в клетках бактерий относительно невелик, в то же время некоторые рекомбинантные микроорганизмы при условии создания определенных генно-инженерных конструкций могут накапливать до 20–25% тотального клеточного белка (так называемая суперпродукция). С учетом этого обстоятельства некото- рыми авторами химическим путем синтезированы гены, построенные из одного или двух повторяющихся типов кодонов незаменимых аминокислот, и осуществлена их экспрессия в микробных клетках в условиях суперпродукции. Микробную массу с высоким содержанием таких гомополипептидов из одной-двух незаменимых аминокислот можно использовать в качестве кормовой добавки, успешно конкурирующей с добавками на основе продуцентов свободных аминокислот. Преодолеть аминокислотный дисбаланс в кормах можно введением в рацион животных растений типа сои, богатых лизином и треонином. Рассмотренные выше формы кормовых добавок более или менее равноценны, вопрос об их применении решается в соответствии с экономическими соображениями. Таким образом, уже в настоящее время генная инженерия вносит свой вклад в решение этой важной народнохозяйственной проблемы в виде микробиологического синтеза лизина и треонина. Однако стоимость кормовых добавок достаточно высокая, тре- буется создание целой отрасли микробиологической промышленности. Поэтому весьма заманчиво выглядит решение этой проблемы путем устранения белкового дефицита непосредственно в растении благодаря изменению аминокислотного состава запасных белков. Проблема аминокислотного дисбаланса связана со специфическими структурно-функциональными особенностями запасных белков злаковых, откладывающихся в зерне, поскольку другие белки этих растений сбалансированы по аминокислотному составу и содержат нормальные количества лизина и треонина. Как известно, у злаковых, в частности у пшеницы и ячменя, основными запасными белками являются спирторастворимые проламины (гордеины у ячменя), содержащие не более 0,9 % лизина (в других белковых фракциях злаковых – альбуминах, глобулинах, глутелинах – содержится 5% лизина). В свою очередь, проламины по молекулярной массе и содержанию серы принято делить на три группы: низкомолекулярные с высоким содержанием серы (В), низкомолекулярные с низким содержанием серы (С) и высокомолекулярные. Для получения сбалансированного по лизину белка злаковых в их проламины следует ввести 15 – 20 лизиновых остатков на полипептидную цепочку или же заменить часть проламинов на богатый лизином белок. С помощью традиционных генетико-селекционных методов в ряде случаев удавалось получить линии и сорта злаковых с повышенным содержанием лизина за счет уменьшения содержания проламина в зерне, вызванного либо прямыми делециями части проламиновых генов, либо мутациями в морфопоэтических генах, которые сопровождались сложными плейотропными эффектами. Во всех случаях часть проламинов в зерне заменялась другими белками, содержащими много лизина. К сожалению, ни одна из этих линий не стала хозяйственно ценным сортом ввиду уменьшения размеров зерна, снижения урожайности и т. п. Конкретные молекулярно-генетические причины этих дефектов в проламиндефицитных растениях, богатых лизином, не установлены. В настоящее время выкристаллизовалось несколько тактических подходов к улучшению аминокислотного состава растительных белков, разработанных главным образом для злаковых. Однако наряду с этим необходимо отметить и появление более общих подходов, рассчитанных на введение и в другие растения искусственно синтезированных неприродных белков. Гены таких белков после их введения в растения типа картофеля могли бы существенно улучшить пищевую ценность этих культур. Возвращаясь к анализу попыток улучшения аминокислотного состава запасных белков зерновых, следует назвать в качестве первого подхода поиск такого белка, который отличался бы высоким содержанием лизина и треонина, а также обладал способностью полноценно заменять определенную часть проламинов при формировании зерна. Дело в том, что одной из возможных причин неудач могут быть замены проламинов случайными белками, нарушающими упорядоченный морфогенез зерна. В настоящее время у злаков идентифицировано несколько белков, богатых лизином, которые по ряду свойств напоминают запасные белки, например, известный ингибитор химотрипсина. Увеличение его содержания в зерне ячменя за счет усиленной экспрессии соответствующего гена еопровождалось параллельным уменьшением содержания проламинов и ростом процентного содержания лизина в зерне. Поэтому существует генно- инженерный проект, рассчитанный на создание рекомбинантных растений злаков либо с амплифицированными генами белков зерна, богатых лизином, либо с генами этих белков, подстроенных под более сильные промоторы. Кандидатом в такие белки является ингибитор химотрипсина. Второй подход к улучшению пищевой и фуражной ценности зерна злаковых исходит из того, что количество проламинов, возможно, является критическим для формирования нормального зерна и любые попытки их замены другими белками будут отрицательно влиять на урожайность и хозяйственно ценные признаки растений. Поэтому улучшать аминокислотный состав можно лишь за счет модификации полипептидной цепи самих проламинов с таким расчетом, чтобы увеличить процентное содержание лизина с помощью изменения нуклеотидной последовательности кодонов, не изменяя при этом общего количества белка. Учитывая важную структурную роль проламинов в формировании зерна, выбирать такие модифицируемые последовательности следует весьма осмотрительно. Анализ первичной структуры разных проламинов, с одной сто- роны, указывает на достаточную вариабельность аминокислотных последовательностей, а с другой стороны, свидетельствует о наличии определенных структурных ограничений. В частности, анализ запасных белков ячменя показал, что низкомолекулярные гордеины содержат домены 1-го и 2-го типов. Первый из них представляет собой многократный повтор после- довательности PQQPFPQ, в которой вообще отсутствуют положительно заряженные аминокислоты. Последние в форме семи аргининовых остатков присутствуют только в домене 2-го типа, входящем в гордеин В и отсутствующем в гордеине С. Таким образом, принимая во внимание первичную структуру повторов доменов 1-го и 2-го типов, можно думать, что подходящим кандидатом на введение лизиновых остатков является лишь домен 2-го типа в гордеине В. При наличии клонированных генов или их к ДНК эквивалентов такая замена может быть осуществлена по всем семи аргининовым остаткам с помощью сайт-специфического мутагенеза. Можно надеяться на то, что поскольку аргинин и лизин принадлежат к одному классу щелочных аминокислот, то такая замена не будет сопровождаться серьезными пертурбациями в структурах белка высшего порядка. Следует, однако, обратить внимание на то обстоятельство, что даже полная замена всех семи аргининовых остатков на лизин в домене 2-го типа гордеина В не решит до конца проблемы амикокислотной сбалансированности запасных белков ячменя, поскольку для ликвидации дефицита требуется введение в 2–3 раза большего числа лизиновых триплетов. На этом пути к цели существует несколько подводных камней. Прежде всего, может оказаться, что все или некоторые аргининовые остатки, подлежащие замене на лизин, на самом деле имеют важное функциональное значение, и поэтому их замена даже на родственную аминокислоту с положительным зарядом может повлечь за собой нежелательные структурные изменения в молекуле гордеина В. Кроме того, в геноме растений имеется большое количество проламиновых генов, поэтому понятно, что модификация и сайт- специфический мутагенез одного гена, успешно трансфицированного в растения, не решат проблемы. Оставшиеся неизменными копии проламиновых генов будут попрежнему синтезировать полипептидные цепи с низким содержанием лизина, поэтому они должны быть элиминированы и заменены на реконструированный высоколизиновый ген. К сожалению, пока имеются лишь самые общие соображения о том, как надо заменять гены, представленные в геноме в виде множественного числа копий. Естественно, остается пока еще до конца не решенной и проблема трансформации и регенерации злаковых, принадлежащих к однодольным, в которых Тi-плазмида не реплицируется, а тотипотентность реализуется с большим трудом. Однако в самое последнее время получены обнадеживающие результаты и с трансформацией и регенерацией некоторых злаков.

Третий путь в решении лизиновой проблемы у злаковых заключается в возможности увеличения содержания свободного лизина в зерне. Этот подход, реализуемый в лаборатории Муфлина основывается на получении мутантов по гену аспартакиназы, первому ферменту в цепи реакций, ведущих к синтезу разветвленных аминокислот. В норме аспартаткиназа злаковых ингибируется по механизму обратной связи свободным лизином и метионином, что и является лимитирующей стадией в синтезе лизина. Ячмень с мутантной фор- мой аспартат-киназы, малочувствительной к ингибирующему действию свободными аминокислотами, содержал в среднем в 2 раза больше лизина, треонина и метионина. Однако вклад этого фактора в общее решение проблемы лизинового дефицита относительно невелик в связи с общим низким содержанием свободных аминокислот в зерне.

Наконец, четвертым подходом к улучшению аминокислотного состава белка любых растений мог бы стать химический синтез генов, которые программируют неприродные полипептиды, построенные в основном из незаменимых аминокислот. Простейшим вариантом такой конструкции являются гомополипептиды, нарабатываемые путем микробиологического синтеза и используемые в качестве кормовых добавок. В зависимости от вида трансформируемых растений, дефицита в них тех или иных аминокислот, особенностей клеточного аппарата транскрипции, трансляции и транспорта белка, взаимодействия таких рекомбинантных белков с метаболическими и регуляторными системами клетки и т. п. состав проектируемых белков может сильно варьировать.

Оценивая в целом итоги и перспективы работ по улучшению аминокислотного состава запасных белков различных растений методами генной инженерии, можно думать, что устранение дефицита незаменимых аминокислот окажется возможным лишь при успешной реализации нескольких из обсуждавшихся выше подходов, по крайней мере, для злаковых.