Клеточная и тканевая биотехнология растений

Научную базу современной селекции составляют генетика (все ее направления — от популяционной до молекулярной), биометрия, физиология и патология растений. Селекционная практика основывается на двух принципиальных подходах: во-первых, создание генетического разнообразия, во-вторых, селекция желательных генотипов.

Используя достижения науки, передаваемый из поколения в поколение опыт, селекционеры создали к настоящему времени сорта важнейших продовольственных, технических, лекарственных растений, обладающие очень высокой потенциальной продуктивностью. Однако желаемый экономический эффект получается только тогда, когда потенциал генотипа сочетается с условиями, созданными для его реализации, т. е. соответствующей агротехникой. Обратная сторона успехов селекции — стандартизация сортов важнейших сельскохозяйственных культур и распространение небольшого их числа на больших площадях. Генетическое разнообразие сужается. Растения становятся более уязвимыми для болезней и вредителей.

Важнейшей задачей селекции в настоящее время является повышение помехоустойчивости продукционного процесса у культурных растений при сохранении или увеличении количества и качества продукта. К давно известным помехам – болезням, вредителям, не благоприятным внешним факторам (экстремальные температуры, засуха, высокая концентрация соли и др.) добавились антропогенные факторы (пестициды, полютанты, уплотнение и нарушение структуры почвы). Для решения этих трудных задач возникла потребность в привлечении новых технологий. Клеточные технологии, основанные на культивировании in vitro органов, тканей, клеток и изолированных протопластов высших растений, могут облегчить и ускорить селекционный процесс. Они предлагают принципиально новые пути для создания генетического разнообразия и отбора форм с искомыми признаками. В эту группу входят технологии, связанные с использованием сомаклональных вариантов и получением индуцированных мутантов на клеточном уровне; клеточная селекция; гибридизация соматических клеток; перенос чу- жеродных цитоплазматических генов; перенос чужеродной генетической информации в виде бактериальных клеток, вирусов и макромолекул; адресованный перенос ядерных генов. Кроме того, клеточные технологии эффективны в создании свободного от вирусов и других патогенов посадочного материала вегетативно размножаемых растений.

Важным вкладом в практику сельского хозяйства может стать и сохранение пула генов вегетативно размножающихся сельскохозяйственных растений и близких диких видов в криобанке, при температуре -196°С, что обеспечивает их полную генетическую идентичность при восстановлении в растущем состоянии. Важнейшие задачи, в решении которых могут помочь клеточные технологии, — создание форм с множественной толерантностью к ряду болезней и неблагоприятных факторов среды, а также увеличение количества белка и обогащение его незаменимыми аминокислотами у зерновых культур (рис, пшеница, кукуруза). В перспективе возможно появление технологий, которые позволят увеличить продуктивность фотосинтеза, создать формы злаков, способных к симбиотической азотфиксации, а также растений, усваивающих элементы почвенного питания в оптимальных количествах.

1.1.1. Культивирование тканей и клеток высших растения Возникший не так давно метод культуры тканей, клеток и изолированных протопластов растений развивался очень быстрыми темпами. В конце XIX — начале XX века немецкие ученые Х. Фехтинг (1892), С. Рехингер (1893), Г. Хаберландт (1902) пытались выращивать изолированные из растений кусочки тканей, группы клеток и корневые волоски на растворах сахарозы. Растущих in vitro тканей они не получили. Хаберландт наблюдал сохранение живыми клеток мезофилла листа в течение нескольких дней. Рехингер отметил, что сегменты тополя, корня одуванчика способны образовать каллус и определил минимальный размер сегмента, способного к каллусогенезу. Эти исследователи высказали ряд идей и гипотез, подтвержденных значительно позже. Фехтинг, изучавший полярность, пришел к выводу, что она свойственна не только органам растения, но и отдельной клетке. Хаберландт выдвинул гипотезу о тотипотентности любой живой клетки растения. В 1922 г. американский исследователь В. Роббинс и независимо от него немецкий ученый В. Котте показали возможность культивирования на синтетической питательной среде меристемы кончиков корня томатов и кукурузы. Однако через определенное время растительные ткани бурели и погибали. Начало успешному развитию метода культуры тканей и клеток высших растений положили работы французского исследователя Роже Готре и американского ученого Филиппа Уайта (1932; 1934). Они начали с анализа и повторения опытов Роббинса и Котте и пошли дальше, показав, что если кончики культивируемых корней периодически пересаживать на свежую питательную среду, то они могут рас- ти и культивироваться неограниченно долго. Готре (1934) ввел в культуру новые объекты — каллусные ткани древесных растений камбиального происхождения и каллусные ткани запасающей паренхимы. Уайт (1939) показал способность тканей растительных опухолей к неограниченному росту при их переносе на свежую питательную среду. В этот период для культивирования растительных тканей начали использовать искусственные питательные среды, в которые в качестве ростовых веществ применяли кокосовое молоко, сыворотку и другие органические добавки, что позволило получать длительные пересадочные культуры из разных органов и тканей растений. В период между 1940—1960 гг. значительно возросло число видов растений, ткани которых выращиваются in vitro. Список, приведенный в классической монографии по культуре ткани, написанной Готре в 1959 г., включал уже 142 вида высших растений. Опытами Ф. Скуга и С. Миллера (1955) по изучению способности к делению и образованию каллуса клетками стебля табака был открыт новый класс стимуляторов роста растений цитокинины. Полученный ими кинетин (6-фурфуриламинопурин) оказался способным в комбинации с β -индолил-3-уксусной кислотой (ИУК) стиму- лировать деление клеток кусочка ткани сердцевинной паренхимы, лишенной проводящих пучков и камбия. Клетки ткани, помещенной на питательную среду с ИУК, но без добавления этого стимулятора, не делились. В последующих работах комбинация ауксинов с цитокининами широко использовалась при культивировании in vitro. В зависимости от концентрации и соотношения стимуляторов можно было усиливать деление клеток экспланта, поддерживать рост каллусной ткани, индуцировать морфогенез. В этот же период был разработан метод получения и выращивания клеточных суспензий, а также метод культивирования отдельной, выделенной из суспензии клетки. Наиболее важным событием в период 1960—1975 гг. была разработка профессором Э.К Коккингом (Великобритания) в 1960 г. метода получения изолированных протопластов из тканей корня и плодов томатов путем обработки их смесью пектолитических и целлюлитических ферментов, выделенных из культуральной жидкости грибов. Были найдены условия культивирования изолированных протопластов, при которых они образуют новую клеточную стенку, делятся и дают начало клеточным линиям, способным в ряде случаев к морфогенезу. Изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточную стенку, были использованы для разработки методов гибридизации соматических клеток путем слияния протопластов и введения в них вирусных РНК, клеточных органелл, клеток бактерий.

В это же время Ж. Морелем и Р.Г. Бутенко разработан метод культуры меристем, позволяющий быстро и с высоким коэффициентом клонально размножать их в асептических условиях. Растения, по- лученные из меристем, были свободны от вирусных инфекций, что позволило получать оздоровленный посадочный материал. Много внимания в этот период уделяли индукции морфогенеза в культуре тканей и клеток. Большое значение для фундаментальных и прикладных проблем приобрело открытие индукции андрогенеза при культивировании изолированных пыльников и использование андро- генеза для получения гаплоидных и дигаплоидных линий.

Интенсивно развивались технологии культивирования одиночных клеток. Впервые были получены и изучены растения- регенеранты табака, представляющие сомаклональные варианты исходной формы. В настоящее время продолжается быстрое развитие техники in vitro, изучение биологии культивируемых объектов и создание технологий на их основе. Разработка методов электрослияния изолированных протопластов, разнообразных методов селекции гибридных клеток значительно облегчила гибридизацию соматических клеток растений.

Методы мутагенеза и клеточной селекции, получения сомакло- нальных вариантов и гаплоидов используются для создания новых форм и сортов важных сельскохозяйственных растений. С помощью методов генной инженерии разработан эффективный метод переноса генов для двудольных растений. Основным итогом быстрого развития технических приемов работы с изолированными тканями и клетками растений явилось понимание исследователями, что для разработки практически важных технологий необходимо изучение биологии используемых объектов на всех уровнях – молекулярном, субклеточном, клеточном и тканевом.

1.1.2. Каллусогенез как основа создания клеточных культур.

Важные для сельского хозяйства технологии in vitro разработаны с использованием объектов разной сложности организации. Основным типом культивируемой растительной клетки является каллусная. Каллусная клетка, в результате деления которой возникает каллусная ткань, или каллус, что означает «мозоль», представляет собой один из типов клеточной дифференцировки, присущей высшему растению. Для растения каллус является тканью, возникающей в исключительных обстоятельствах (обычно при травмах) и функционирующей непродолжительное время. Эта ткань защищает место поранения, накапливает питательные вещества для регенерации анатомических структур или утраченного органа. Каллус – это ткань, возникшая путем неорганизованной пролиферации клеток органов растений. Пролиферация – процесс новообразования клеток и тканей путем интенсивного размножения. Каллусная ткань представляет собой аморфную массу тонкостенных клеток, не имееющую строго определенной анатомической структуры. In vitro она в основном бывает белого или желтоватого, реже светло-зеленого или красноватого цвета. Темно-коричневая окраска возникает чаще при старении каллусных клеток и связана с на- коплением в них фенолов, которые окисляются в хиноны. Для получения культивируемых каллусных клеток фрагменты тканей разных органов высших растений помещают в пробирки, колбы, чашки Петри на искусственную питательную среду. Фрагмент ткани или органа, инкубируемый на питательной среде самостоятельно или используемый для получения первичного каллуса, называют эксплантом, а процесс образования каллуса из экспланта – каллусогенезом. Выбор экспланта определяется конкретными задачами, стоящими перед исполнителем работ. Прежде всего следует убедиться, что выбранный эксплант находится в подходящем биологическом состоянии, которое необходимо для получения каллусных культур. Молодые ткани более пригодны для этой цели, чем зрелые. Кусочки стебля древесных пород часто служат плохим материалом. Семена представляют собой хороший исходный материал. Размер и форма экспланта особого влияния на образование каллуса не оказывают, хотя существует минимальный критический размер, при котором каллусогенез не идет. Часто эксплант, используемый для получения каллуса, является фрагментом органа и включает ткани, клетки которых различно дифференцированы. Так, взятый целиком фрагмент стебля имеет в своем составе клетки эпидермальные, первичной коровой паренхимы, камбия и сосудистой системы, сердцевинной паренхимы. В разных условиях культивирования и в зависимости от различий в физиологическом состоянии исходного растения можно наблюдать преимущественную пролиферацию клеток либо камбия, либо коры, либо сердцевинной паренхимы. Различное тканевое происхождение первичных каллусных клеток является одной из причин гетерогенности культуры каллусной ткани, так как некоторые функциональные особенности исходных дифференцированных клеток передаются в ряду клеточных поколений как стойкие, эпигенетически наследуемые признаки. Процесс получения первичного каллуса и поддержание пересадочной культуры требуют абсолютной асептики. Для этого экспланты стерилизуют с помощью различных стерилизующих растворов, содержащих чаще всего активный хлор или ртуть (гипохлориты, сулема, диацид), к которым для лучшего смачивания добавлены детергенты. Основные компоненты питательных сред для культуры тканей и клеток растений – минеральные соли (макро- и микроэлементы), источник углеродного питания (обычно сахароза или глюкоза), витамины, регуляторы роста. Иногда в состав питательных сред включают комплексные органические добавки. Обязательным условием превращения растительной клетки в каллусную является присутствие в питательной среде представителей двух групп фитогормонов: ауксинов и цитокининов. Различно дифференцированные клетки экспланта на питательной среде in vitro переходят к сложному прцессу дедифференцировки и образованию первичного каллуса. Дедифференцировка – это процесс потери структурных и функ- циональных особенностей специализированных неделящихся клеток и переход их к пролиферации. Ауксины вызывают процесс дедифференцировки клетки, подготавливающий ее к делению, а цитокинины – пролиферацию дедифференцированных клеток. Если в питательную среду без гормонов поместить кусочек стебля, листа, корня (без верхушки) или любой другой растительный эксплант, состоящий из специализированных (дифференцированных) клеток, то деления клеток не произойдет и каллусная ткань не образуется. Это связано с неспособностью дифференцированных клеток к делению. Каждая клетка проходит три фазы роста: 1) деление; 2) растяжение; 3) дифференцировку. Характерной чертой заключительной фазы роста является утолщение вторичной клеточной оболочки и потеря клеткой способности к делению. Для того чтобы дифференцированные клетки вновь приобрели способность к делению, необходимо, чтобы произошла их де- дифференцировка, т. е. клетки как бы возвратились в меристематическое состояние. Размножение дедифференцированных клеток приводит к анархическому, неорганизованному росту, в результате чего образуется каллусная ткань. Таким образом, превращение специализированной клетки в каллусную связано с индукцией клеточного деления, способность к которому она потеряла в процессе дифференцировки. Переход клетки in vitro из дифференцированного состояния к дедифференцировке и активным клеточным делениям обусловлен изменением активности генов (эпигеномной изменчивостью). Дедифференцировка начинается с использования запасных веществ и разрушения специализированных клеточных органелл. Состав питательных сред, применяемых при культивировании тканей растений зависит от выбранного обьекта. В настоящее время разработано большое количество питательных сред значительно различающиеся по составу((Мурасиге и Скуга, 1962г. Гамборга и Эвелега (В5), 1968 г. Уайта,1939 г. Нич, 1974 г. Као и Михайлюка, 1975 г. Китайские среды N6 с картофельным экстрактом и другие). Через 6–12 ч после индукции дедифференцировки клеточная оболочка разрыхляется и разбухает, увеличивается число свободных рибосом, возрастает число элементов аппарата Гольджи, увеличиваются размеры и число ядрышек. В готовящейся к делению клетке стимулируется синтез всех форм РНК, начинается репликация ядерной ДНК. Все эти изменения предшествуют началу делений клеток, которые начинаются через 48—72 ч. Активирование одних генов и репрессирование других приводит к изменению в белковом составе клеток. Исчезают тканеспецифичные белки-антигены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток и для каллусной ткани. У двудольных растений процесс репрессии и дерепрессии генов, лежащий в основе дедифференцировки, происходит легче, чем у однодольных. Следует учитывать, что в клетках экспланта в начале культиви- рования могут наблюдаться изменения в метаболизме, вызванные как дедифференцировкой, так и травматическими синтезами. Специ листы предполагают, что травма приводит к высвобождению из клеток биологически активных веществ – индукторов или элиситоров клеточных делений, отличающихся по своей природе от известных нам сейчас стимуляторов роста растений (ауксинов, цитокининов, гиббереллинов). В роли таких элиситоров могут выступать продукты разрушения полисахаридов клеточной стенки. Поэтому лучше проводить прединкубацию экспланта на безгормональной среде 3–6 сут. Образование каллуса не во всех случаях связано с поверхностью экспланта. Каллус может образоваться в результате пролиферации внутренних тканей без связи с поверхностью среза. Развивающийся каллус разрывает слой ткани и выходит на поверхность. Примером образования каллуса, не связанного с травмой, служит каллусогенез, наблюдающийся в культуре изолированного пыльника. Каллусные ткани культивируют поверхностным способом на полутвердой агаризованной среде (концентрация агара 0,6–1,0%) или среде с применением других желирующих веществ, либо на мостиках из фильтровальной бумаги, или полипеноуретана, погруженных в жидкую неагаризованную среду. Каллусная клетка имеет свой цикл развития и повторяет развитие любой клетки, включая деление, растяжение и дифференцировку, после чего наступают старение и отмирание клетки.

Ростовая кривая каллусных клеток имеет S-образную форму и включает пять фаз. Во время 1-й латентной, или лагфазы, увеличения числа или массы клеток не происходит. Клетки в этот период подготавливаются к делениям. 2-я фаза – логарифмическая или экспоненциального роста – характеризуется наибольшей митотической активностью и увеличением массы каллусной культуры. Рост происходит с ускорением. 3-я фаза – линейная, в которой скорость роста клеток постоянна. Далее наступает 4-я фаза – замедленного роста, когда митотическая активность клеток резко снижается. В следующей 5-й фазе – стационарной ростовая кривая выходит на плато. Скорость нарастания клеточной массы равна нулю. После стационарной фазы наступает отмирание (деградация) клеток, во время которой число и масса живых клеток уменьшается. Для того чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и отмирания каллусных клеток, первичный каллус, возникающий на эксплантах, через 4–6 недель переносят на свежую питательную среду. Часть каллусной культуры, используемую для пересадки на свежую питательную среду, называют трансплантом, а операцию переноса транспланта в другой культуральный сосуд – пассированием или субкультивированием. Субкультивирование рекомендуется проводить, используя трансплант из фазы замедления роста или ранней стационарной фазы предыдущего цикла выращивания. При регулярном пассировании способность к делению может поддерживаться в течение десятков лет. В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусная ткань может быть разной консистенции: 1) рыхлой, состоящей из сильно оводненных клеток, легко распадающейся на отдельные мелкие агрегаты; 2) средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами; 3) плотной, в которой дифференцируются элементы камбия и проводящей системы. Как правило, в длительной пересадочной культуре на средах, включающих ауксины, особенно синтетический аналог ауксина —2,4- дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), каллусные ткани теряют пигментацию и становятся более рыхлыми. Каллусные клетки in vitro сохраняют многие физиолого- биохимические черты, свойственные нормальным клеткам, входящим в состав растительного организма. Они сохраняют способность к синтезу вторичных метаболитов. Морозостойкость и способность к закаливанию свойственны каллусным клеткам, полученным от морозостойких растений. Этим качеством не обладают каллусные ткани, полученные от тропических и субтропических культур. Общим у каллусных и нормальных клеток растения является также устойчивость к действию высоких температур, осмотически активных веществ, засолению. Вместе с тем каллусные клетки отличаются от нормальных боль- шой генетической гетерогенностью и физиологической асинхронностью. В результате выхода из-под контроля организма рост каллусных клеток происходит неорганизованно и является неограниченным. Клеточный цикл у каллусных клеток более длительный, чем у растений, произрастающих в открытом грунте. Особенностью каллусных клеток является гетерогенность по возрасту. В каллусной ткани одновременно присутствуют клетки в различных фазах цикла клеточных делений. Значительные отличия наблюдаются и в энергетическом обмене каллусных клеток. Они потребляют меньше кислорода по сравнению с нормальными. Такая же особенность обнаружена у меристематических клеток. Дыхание перестает подавлять брожение, и даже в присутствии кислорода в каллусных клетках наряду с дыханием идет бескислородное расщепление углеводов – брожение, о чем свидетельствует накопление этилового спирта в делящихся клетках. Это явление наиболее выражено в опухолевых клетках, что приводит к очень резкому (в 19 раз) увеличению потребления ими углеводов. Митохондрии в каллусных клетках так же, как и в меристематических, слабо развиты, в них мало крист, что не может не оказывать влияния на активность аэробного дыхания.

Генетика каллусных клеток. Длительное время считали, что каллусные клетки генетически строго однородны. Однако в 60-х годах было выяснено, что клетки каллусной ткани обладают выраженной генетической гетерогенностью. Генетическая неоднородность каллусных клеток выражается прежде всего в различной плоидности, т. е. каллусные клетки отличаются по числу хромосом. Генетически стабильными in vitro являются меристематические ткани. В каллусных и суспензионных культурах встречаются клетки, имеющие диплоидный набор хромосом, свойственный исходному растению, полиплоидные клетки, содержащие 3, 4, 5 и более хромосомных наборов. Наряду с полиплоидией в культуре каллусных тканей можно нередко наблюдать анеуплоидию (возрастание или уменьшение хромосомного набора на несколько хромосом). Чем длительнее культивировать каллусные клетки, тем больше они различаются по плоидности. В каллусных клетках табака через четыре года культивирования совсем не остается диплоидных клеток: все клетки становятся полиплоидными или анеуплоидными. Возможно, что изменение плоидности происходит под влиянием условий культивирования и прежде всего входящих в состав питательной среды веществ. Кроме того, полиплоидные клетки имеют меньшую лагфазу и поэтому быстрее переходят к делениям, чем диплоидные. Вследствие этого они и получают преимущество в дальнейших пассажах. Культивирование клеток и тканей растений in vitro вызывает также появление в клетках хромосомных аббераций, что сказывается на биологических особенностях культивируемых тканей, изменяя их внешний вид, обмен веществ, скорость роста. Причины генетической нестаильности культивируемых клеток заключатся в следующем: генетическая неоднородность исходного материала (гетерогенность экспланта). У многих растений дифференцированные ткани характеризуются наличием клеток разной плоидности и лишь активно пролиферирующие в течение онтогенеза ткани, такие, как верхушечные меристемы, камбий и другие, остаются всегда диплоидными; длительное пассирование тканевых и клеточных культур, приводящее к накоплению в них генетических изменений; нарушение коррелятивных связей при изолировании участ- ков тканей растений и помещении их на питательную среду; влияние на генетический аппарат клетки входящих в состав питательных сред фитогормонов. О мутагенном действии ауксинов и цитокининов известно из целого ряда работ.

Наиболее активным мутагеном является 2,4-Д, входящий в состав большинства питательных сред. Цитокинины, в частности кинетин, способствуют полиплоидизации клеток. Генетическое разнообразие каллусных клеток позволяет использовать их для клеточной селекции на устойчивость к неблагоприятным фактором среды, фитопатогенам и на повышенную про- дуктивность база для осуществления генноинженерных и других биотехнологических работ с использованием в производстве новых трансформированных генотипов растений.