Типи морфогенезу в культурі клітин та тканин рослин.

Морфогенез (изменение морфологии) - это процесс развития и формирования клеток, органов, частей организма в онтогенезе в природе и в культуре in vitro, что сопровождается дифференцированием клеток и тканей.
В условиях in vitro определяют такие типы морфогенеза:

1) гистогенез - образование неорганизовано растущими каллусными клетками элементов тканей(меристемних, проводящих, механических, например волокон, ситоподобных элементов, трахеид;);
2) органогенез - образование органов: ризогенез – процесс развития корня, гемогенез – процесс развития почки. Органогенезом является процесс, во время которого в клетках или тканях происходят изменения, которые приводят к образованию однополярной структуры, а именно: побегового или корневого примордия (зачатка).

Органогенез является многостадийным процессом и состоит из трех основных этапов:

1. формирование побеговой почки(гемогенез);

2. рост и развитие побега;

3. укоренение побега.

Органогенез может проходить непосредственно из експланта или через образование каллуса. РИСУНОК!!!!!!!!!!

Почки возникают в результате полиферации многих клеток. Поэтому при при регенерации по типу органогенеза возможно появление химерных растений, т. е. растений, у которых в разных частяхрастения присутствуют клетки с разным набором хромосом.

3) ембриоидогенез (соматический эмбриогенез) - образование ембриоидов, которые содержат(подобно зародышу) зачатки главных органов - стебля, корня. Эмбриоид (или соматический зародыш) – это биполярная структура, внешне напоминающая зародыш того же вида с сопряженным развитием апиксов побега и корня. Развивается асексуально из соматических клеток.

38. Культура рослинних протопластів. Парасексуальна гібридизація у рослин Изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточной стенки, могут сливаться между собой. Слияние протопластов - своеобразный метод гибридизации, так называемая парасексуальная, или соматическая гибридизация. В отличие от обычной, где сливаются половые клетки (гаметы), в качестве родительских при парасексуальной гибридизации используются диплоидные клетки растений. Внеядерные генетические детерминанты у большинства высших растений наследуются в половом процессе строго одноядерно и матерински. Техника парасексуальной гибридизации может позволить:

• скрещивание филогенетически отдаленных видов растений (организмов),
• получение асимметричных гибридов, несущих генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами, органеллами или цитоплазмой другого,
• слияние трех и более клеток,
• получение гибридов, представляющих сумму генотипов родителей,
• перевод мутаций в гетерозиготное состояние, что позволяет получать жизнеспособные формы при слиянии протопластов, поскольку мутагенез довольно часто дает дефектное по морфогенезу растение,
• получение растений, гетерозиготных по внеядерным генам и др.

Парасексуальная гибридизация важна для анализа как ядерных генов, так и внеядерных геномов. Цитоплазматический геном кодирует ряд признаков - скорость фотосинтеза, устойчивость к патогенам, абиотическим факторам и т. д. Наличие косегрегация генов (признаки, контролирующие внеядерный геном, сегрегируют совместно) свидетельствует о физическом сцеплении генов.

Слияние бывает спонтанным (чаще у протопластов из молодых тканей или суспензионных культур) и индуцированным. Для стимуляции слияния протопластов предложен ряд методов, как физических, так и химических.

При слиянии протопластов различных растений, например, А и В, могут с равной вероятностью образовываться комбинации АА, ВВ и АВ. Желаемый продукт слияния - АВ, поэтому разрабатываются способы увеличения частоты слияния именно такого типа и избирательного выделения только продукта слияния АВ. Один из таких методов заключается в следующем. Поверхность протопласта обычно несет отрицательный заряд. Путем обработки ее фосфолипидом, несущим положительный заряд, можно временно придать поверхности протопласта положительный заряд. Если теперь протопласты А, имеющие положительный заряд, смешать с необработанными протопластами В, несущими отрицательный заряд, то будут в основном образовываться комбинации АВ в результате притяжения разноименных зарядов.

Разработаны также методы маркирования протопластов того или иного растения с помощью разных флуоресцентных красителей. Если обработать протопласты одного растения флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), а протопласты другого растения родаминизотиоцианатом (RITC), то можно, не изменяя активности клеток, пометить их желто-зеленой (FITC) или красной (RITC) флуоресценцией. Гибриды, образовавшиеся путем слияния разных типов клеток, будут иметь оба цвета флюоресценции - желто-зеленый и красный.

Судьба геномов (ядерного и цитоплазматического) после слияния протопластов может быть различной:

1. Ядерные генетические детерминанты наследуются как дву-, так и однородительски. В последнем случае ядра не сливаются и впоследствии сегрегируют в процессе клеточных делений.

2. Внеядерные генетические детерминанты наследуются двуродительски. При этом в межвидовых комбинациях прослеживается тенденция к соматическому выщеплению и элиминации одного из родительских цитоплазматических геномов.

3. Возникновение гибридных клеток и растений в результате слияния более чем двух родительских клеток.

Таким образом, слияние протопластов приводит либо к образованию гибрида, либо к образованию цибрида. Соматический гибрид - продукт слияния и цитоплазмы, и ядра обоих протопластов. Цибрид (цито­плаз­матический гибрид) - растение-регенерант, содержащее цитоплазму обоих родителей и ядро одного из них. Цибриды получают, облучая перед слиянием один из протопластов γ-лучами для разрушения ядра. Скрининг таких клеток проводится по генам – маркерам ядерного и цитоплазматических (митохондриального и хлоропластного) геномов.

При слиянии могут образовываться и так называемые асимметричные гибриды – продукты слияния, имеющие полный хромосомный набор одного из партнеров и часть хромосом другого партнера. Такие гибриды часто возникают при слиянии клеток организмов, филогенетически удаленных друг от друга. В этом случае вследствие неправильных делений клетки, обусловленных некоординированным поведением двух разнородных наборов хромосом, в ряду поколений теряются частично или полностью хромосомы одного из родителей. Асимметричные гибриды бывают устойчивее, плодовитее и жизнеспособнее, чем симметричные, несущие полные наборы генов родительских клеток. В целях асимметричной гибридизации возможна избирательная обработка клеток одного из родителей для разрушения части его хромосом. Возможен прицельный перенос в клетку нужной хромосомы.Гибриды могут быть получены путем слияния трех и более родительских клеток. Из таких гибридных клеток могут выращены растения – регенеранты.

39. Трансплантація ембріонів. Метод та значення.

Кардинальное решение проблемы ускоренного воспроизводства скота состоит в том, чтобы перейти к нетрадиционным способам увеличения плодовитости. Для этого применяется целый ряд биотехнических методов, разработанных на основе углубленных исследований репродуктивной функции, её регуляции, а также на совершенствовании приемов манипуляции с эмбрионами, половыми и соматическими клетками. В последнее время приобрела практическое значение трансплантация эмбрионов, которая рассматривается как эффективный метод биотехнологии ускоренного размножения высокоценных племенных животных.

Принципиальная биологиче­ская возможность искусственного осеменения заключена в ог­ромном «перепроизводстве» спермиев в организме самцов. Для оплодотворения яйцеклетки требуется всего один спермий, а в дозе, вводимой при искусственном осеменении, их должно быть миллионы, а организм самца производит их миллиарды. Боль­шие биологические потенции к воспроизводству имеются и у са­мок млекопитающих, в яичниках которых содержатся десятки и даже сотни тысяч ооцитов. Естественным путем лишь единицы из них реализуются в потомстве. В отличие от самцов препятст­вием на пути более рационального использования воспроизво­дительного потенциала самок млекопитающих является необхо­димость вынашивания ими потомства в период эмбрионального развития. Это препятствие может быть устранено, если самку использовать в роли донора, только не гамет, как самца, а эм­брионов. Для вынашивания же потомства необходим «инку­батор».

В настоящее время для этого может быть использована един­ственная возможность - организм приемных матерей (реципиен­тов) того же вида. Поэтому, если одних коров использовать только в качестве доноров ранних эмбрионов, то других можно было бы использовать только в качестве реципиентов - естест­венного инкубатора для доращивания эмбрионов. Это позволило интенсифицировать воспроизводство отдельных самок за счет реализации потенциальных запасов яйцеклеток в их яичниках. Таким образом, за один год от ценных племенных коров можно было бы получить не одного, а значительно большее число по­томков. При этом в качестве приемных матерей подойдут менее продуктивные, чем доноры, коровы или просто телки, собствен­ная продуктивность которых еще неизвестна На современном этапе одним из основных методов совершенствования молочного скота является искусственное осеменение. Однако оно не обеспечивает в достаточной мере ускоренного выведения животных с высокими показателями продуктивности. В настоящее время на базе интенсивного использования генетически ценных быков-производителей с применением искусственного осеменения коров темпы селекции в сравнении с обычными увеличиваются в 2-3 раза. В то же время генетический вклад в прогресс селекции матерей быков почти в 2 раза ниже вклада отцов быков. Это объясняется низкой интенсивностью селекции матерей быков и ненадежной оценкой их племенной ценности из-за получения небольшого числа потомства. В странах с развитым молочным животноводством для повышения генетического прогресса проводится интенсивный отбор коров - потенциальных матерей быков. Таких коров используют в качестве доноров генетически ценных эмбрионов. Применение технологии трансплантации эмбрионов позволяет в короткие сроки получать высокоценные маточные семейства и более точно оценивать качество потомства.

 

 

40. Трансгенез. Методи, що застосовуються при проведенні трансгенезу.

Трансгенез - искусственный перенос гена или группы генов из одного организма в другой и создание условий для его/их экспресии (т.е. выражения: транскрипции, трансляции, приводящих к появлению в клетках организма-реципиента биологически активного генного продукта).

Для трансгенных работ с животными используют вектора, разработанные на основе ДНК вирусов (например, SV40, вируса бычьей папилломы и т.д.). Перенос таким способом полезных генов оказался возможен после ослабления путем генно-инженерных манипуляций патогенности вируса для клеток организма-реципиента. Весьма полезными качествами вирусных векторов-носителей является способность многих из них встраиваться в ДНК клетки хозяина, а также легко проникать в клетку путем обычной инфекции

В отношении растений наиболее используемыми векторами - носителями являются Ti (tumor inducing) и Ri (root-inducing) плазмиды, выделенные из бактерий, способных образовывать с высшими растениями сложные симбиотические ассоциации. Ti плазмиды содержат в составе своей ДНК так называемые T-участки (от английского transfer - перенос), способные встраиваться в ядерный геном некоторых растений. Встраивание в T-участок нужного гена превращает Ti-плазмиду в вектор - носитель для трансгенных манипуляций. Необходимо также отметить, что генная инженерия и трансгенез у растений могут затрагивать не только ядерный наследственный материал, но и ДНК хлоропластов и митохондрий. Так, в митохондриях кукурузы были обнаружены плазмиды S-1 и S-2, что открывает определенные возможности для введения туда чужеродных генов