Фітогормони, що використовуються в біотехнології рослин.

Важным фактором, регулирующим дифференциацию и морфо­генез изолированных тканей, является наличие в питательной сре­де регуляторов роста — ауксинов, цитокининов, гиббереллинов. Подбирая соотношение и концентрацию этих веществ, можно на­правленно регулировать их органогенное действие. Для каждого вида, а иногда и сорта растения экспериментально должен быть установлен соответствующий уровень фитогормонов в среде.

Чаще всего применяются следующие ауксины: а-нафтилуксус-ная кислота (НУК) в концентрациях 0,1—2 мг/л, р-индолилуксус-ная кислота (ИУК) в концентрациях 1-30 мг/л, 2,4-дихлорфенок-снуксусная кислота (2,4-Д) в концентрациях 1-10 мг/л.

Для индукции образования каллуса обычно используют 2,4-Д, которая более активна, чем ИУК и НУК. Для тканей однодоль­ных используют довольно высокие концентрации 2,4-Д — 2-10 мг/л, для получения каллусных культур двудольных вводят в среду ИУК—1-10 мг/л. Во многих случаях низкие уровни аукси­нов способствуют морфогенезу корней, образованию луковичек, стимулируют эмбриогенез.

Обязательным компонентом питательных сред являются веще­ства группы цитокининов: кинетин (6-фурфуриламинопурин), бен-зиламинопурин (БАП), зеатип (природный цитокипин), N-изопен-тиленаминонурин (2П).

Цитокинины снимают апикальное доминирование и индуциру­ют развитие пазушных почек в культуре апексов, стимулируют рост покоящихся органов. Для реализации морфогенетических ре­акций изолированным тканям необходимы экзогенные цитокини­ны, под действием которых происходит дефференциаиия в каллус­ных культурах, образование стеблевых почек и побегов. Цитоки­нины регулируют рост соматических зародышей и формирование растений, замедляют старение органов и повышают их устойчи­вость к неблагоприятным условиям внешней среды.

Гиббереллины усиливают рост стебля, листьев, индуцируют прорастание семян, снимают состояние покоя. При микроразмно­жении используют в основном гиббереллин А₃ (гибберелловая кислота) в концентрациях 0,1—0,5 мг/л, это способствует ускоре­нию роста сформировавшихся почек и получению растений с хо­рошо развитой надземной частью. Гиббереллины стимулируют развитие органов, но обычно подавляют процессы их заложения.

Совместное внесение в среду веществ разных групп действует синергически или антагонистически. Например, кинетин усиливает каллусогенное действие ауксинов, но снижает их корнеобразующее влияние. Ауксины в низких концентрациях повышают дей­ствие цитокининов, направленное на образование адвентивных по­чек, а цитокинины в низких концентрациях усиливают корнеобразующее действие ауксинов.

Одержання вторинних метаболітів в культурі клітин та тканин рослин.

Вторичными метаболитами является антибиотики, микотоксини, пигменты, фенольные соединения, гликозиды, алкалоиды, каучук и резина, эфирные масла, гидроароматические соединения. Много из этих веществ не берут активную участь в клеточном метаболизме, а некоторые из них являются жизненно необходимыми для нормального функционирования и развития организма.

Во время производства вторичных биопродуктов часто возникает нестабильность. Поэтому для промышленного производства нужно использовать клеточные культуры, которые имеют высокую производительную стабильность.

Получение клеточных культур для производства биологически активных веществ возможно из любой ткани или органа целого растения, выращенного в открытой или закрытой почве. Часто для этого используют стерильные проростки, полученные из семян в условиях in vitro.

Выращивание клеточных культур в ферментере в больших масштабах для получения биологически активных веществ подобное культивированию микроорганизмов. Клетки растений можно культивировать в контролируемых условиях на питательной среде определенного состава, в отличие от выращивания растений в открытой почве, где они часто испытывают неконтролированное влияние биотичних и абиотичних факторов окружающей среды.

Калюси растений и культуры клеток культивируют в стерильных условиях на специальных агаризованих или жидких питательных средах в сурово контролируемых условиях.

Для получения вторичных продуктов используют суспензионные культуры. Суспензионные культуры обладаю большой морфологической, биохимической, генетической свойствами и ускорением роста. Синтез вторичных продуктов пов’язан с дифференцированием клеток.

Для повышения производительности культивируемых клеток широко и во многих случаях успешно применяют:

ü Клеточную селекцию, которая основывается как на спонтанной, так и на индуктируемой разными мутагенами изменчивости культивируемых клеток;

ü Оптимизацию условий выращивания и составов ростовых и продукционных питательных сред;

ü Культивирование дифференцированных культур, клеток, или индукцию дифференцирования; использование елиситорив.

Чаще всего используют методы генетической инженерии. Наибольших результатов получила трансформация клеток с помощью бактерий Agrobacterium rhizogenes и получения так называемых бородатых корней, производительность которых значительно более высока, чем обычных недифференцированных культур. Повышают синтез вторичных метаболитив путем усиления активности соответствующего фермента.

 

Методы генной иммунизации

Новый подход, позволяющий индуцировать у организма иммунный ответ без введения анти­гена, основан на включении в клетки животно­го-мишени гена, кодирующего белок-антиген. В первых экспериментах такого рода Е. соli-плазмиду, конъюгировали с микрочастицами золота и бомбардировали ими клетки уха мыши. Впос­ледствии выяснилось, что клонированную кДНК можно вводить в клетки и с помощью внутримышечной инъекции раствора с боль­шим количеством плазмиды, несущей соответ­ствующую ДНК. Этот подход позволяет избежать очистки антигена, что требует много времени и средств, или использования для создания вакцины технологии рекомбинантных ДНК. Кроме того, получаемые с его помощью белки с большей вероятностью подвергаются правильной посттрансляционной модифика­ции, чем белки, синтезируемые организмами-хозяевами. Этот метод, получивший название генной иммунизации, можно использовать для вакцинации домашних животных.

Перспективы генной иммунизации были тщательно изучены. ДНК-иммунизация позволяет не только из­бежать очистки белковых антигенов, но и инду­цировать иммунный ответ, направленный именно на кодируемый плазмидой белок, а не на саму плазмиду. Поэтому один и тот же вектор можно использовать для доставки разных бел­ков или для многократного введения одного и того же гена.

Судьба введенной в клетку ДНК точно неиз­вестна. В принципе она может интегрировать в геном хозяина с весьма серьезными последст­виями, если при этом затрагивается какой-то важный ген или происходит злокачественная трансформация клетки. Такая ДНК какое-то время просуществует в клетке в виде нереплицирую-щегося внехромосомного элемента, а затем разрушится.

Генную иммунизацию пока ис­пользуют для выработки иммунитета к некото­рым патогенным микроорганизмам (вирусу гриппа А, вирусу иммунодефицита человека типа I, вирусу бычьего герпеса, вирусу бешен­ства) у животных, но не у челове­ка.

Для облегчения доставки ДНК в клетки жи­вотных при проведении генной иммунизации был создан модифицированный штамм Shigella flexneri. Эта бактерия проникает в эпителиаль­ные клетки животных путем фагоцитоза, и при­сутствующая в ней плазмидная ДНК попадает в цитоплазму клетки-хозяина, где и происходят транскрипция и трансляция переносимого ею ге­на, находящегося под контролем эукариотического промотора.

Эксперименты, в которых в качестве векто­ра для доставки ДНК в клетки использовалась Shigella, были проведены на морских свинках, и хотя они оказались успешными, судить о без­опасности данной системы можно будет лишь после проведения клинических испытаний. Огромным преимуществом этого подхода яв­ляется возможность перорального введения вакцин.