Технологія отримання гаплоїдних рослин та гомозиготних ліній на базі гаплоїдів та подвоєних гаплоїдів в культурі пильників.

Гаплоиды получают двумя способами. Первый способ классический – отдаленная гибридизация, когда в зиготе отдаленного гибрида хромосомы одного из видов элиминируют. Второй способ основан на методиках культивирования in vitro, где из неоплодотворенных половых клеток с редуцированным набором хромосом можно регенерировать целые растения. Обычно они стерильны, так как у них нарушено формирование мужских и женских гамет. При культивировании in vitro, однако, может произойти спонтанное удвоение хромосом, или его можно вызвать искусственно, например, обработав колхицином клетки или растения. Дигаплоиды фертильны и вполне жизнеспособны.

Наиболее распространены следующие методы индуцирования гаплоидов:

· индуцированный андрогенез в культуре пыльников и пыльцы;

· селективная элиминация хромосом в гибридном зародыше. Этот метод чаще всего используется в селекции злаковых;

· псевдогамия - развитие гаплоидного зародыша после оплодотворения инородной пыльцой без оплодотворения яйцеклетки или же развитие изолированной семяпочки (гиногенез).

Получение гаплоидных растений из изолированных пыльников может идти по двум направлениям: прямая регенерация соматических зародышей и косвенная - через каллусогенез. В первом случае внутри пыльников из отдельных пыльцевых зерен формируются проэмбриональные структуры, которые при определенных условиях культивирования развиваются в эмбриоиды, дающие начало гаплоидным растениям. Эмбриоиды - зародышеподобные структуры. Во втором - пыльца делится, но клетки, возникшие в результате делений, быстро увеличиваются в размерах и, разрывая оболочку пыльцевого зерна, образуют каллус. В результате дальнейшего морфогенеза из этих каллусных клеток регенерируют растения. При этом растения могут иметь разную степень плоидности - ди-, поли-, анеуплоидные. Последние часто стерильны, но после обработки растений колхицином происходит удвоение числа хромосом, в результате чего можно получить фертильные гомозиготы.

Культура пыльцы представляет собой культивирование микроспор, освобожденных от соматических тканей пыльника, в жидкой среде. Пыльцу от соматической ткани пыльника отделяют несколькими способами:

1. Спонтанное высвобождение (пассивный способ) - пыльники определенным образом обрабатываются, инкубируются на жидкой среде, где лопаются, а пыльца высвобождается и всплывает наверх.

2. Гомогенизация и фильтрация. Пыльники, культивируемые в жидкой среде, разрушают, надрезая скальпелем и осторожно надавливая, затем фильтруют (поры фильтра 50 -100 мкм) и центрифугируют. Осадок промывают и суспендируют в жидкой среде.

3. Разрезание - разрезают стенку пыльника. Этот метод применяется редко, так как трудоемок и длителен.

 

ОЦЕНКА СПЕРМЫ.

На племпредприятиях (станциях) и пунктах искусственного осеменения сельскохозяйственных животных прежде всего проводят глазомерную оценку спермы под микроскопом. Для этого на чистое предметное стекло наносят каплю спермы, накрывают ее покровным стеклом и кладут на предметный столик микроскопа. Предметные и покровные стекла заблаговременно моют и просушивают. Исследуемая капля спермы должна быть достаточно большой, чтобы все пространство между покровным и предметным стеклами было заполнено спермой,

Глазомерная оценка спермы заключается в приблизительном определении под микроскопом густоты (насыщенности спермиями) и процента живых спермиев с прямолинейным поступательным движением (подвижности). Редкая сперма —в поле зрения микроскопа спермии разбросаны, промежутки между ними допускают свободное их передвижение. Редкую сперму условно обозначают буквой Р.

Различают также сперму с оценкой А (азооспермия), когда в поле зрения микроскопа совсем нет или очень мало спермнев.

Для достижения разной степени увеличения к микроскопу приложено несколько (2—3) окуляров. Сперму исследуют при температуре 38—40°, для чего используют термостаты или обогревательные столики. В зависимости от количества спермиев, которое наблюдается в поле зрения микроскопа, различают густую, среднюю и редкую сперму. Густая сперма — все поле зрения микроскопа сплошь заполнено спермиями с самыми незначительными промежутками между ними. Густую сперму условно обозначают буквой Г. Сперма средней густоты—в поле зрения микроскопа между отдельными спермиями наблюдаются промежутки, приблизительно равные длине одного спермия. Среднюю сперму условно обозначают буквой С. Кроме густоты спермы, под микроскопом определяют количество живых спермиев, имеющих прямолинейное поступательное движение.

 

8. Конечная цель экстракорпорального оплодотворения созревших in vitro ооцитов - получение эмбрионов, пригодных для трансплантации. При культивировании ранних эмбрионов крупного рогатого скота в большинстве

случаев эмбриональное развитие блокируется на стадии 8-16 клеток, т.е. когда в естественных условиях эмбрионы переходят из яйцевода в матку. Лишь единичные эмбрионы развиваются до стадий поздней морулы или бластоцисты, пригодных для трансплантации. В то же время установлено, что если культивировать in vitro ранние морулы, то можно получить высокий % бластоцист (60-80%) и даже выход эмбрионов из зоны пеллюцида. Инкубацию эмбрионов проводят двумя способами: в яйцеводе кролика, овцы или коровы и культуральных средах.

В 1983 г. во ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных был получен живой теленок из созревшего in vitro и экстракорпорально оплодотворенного ооцита. В эксперименте хирургическим методом трансплантировали ранних (2-4-клеточных) эмбрионов в яйцевод коровы.

Более совершенен метод, когда используют промежуточного хозяина или временного реципиента — овцу, кролика или корову. Это позволяет получить морулы или бластоцисты для нехирургической пересадки коровам —реципиентам. При этом с помощью перекрестного культивирования можно дважды проводить селекцию эмбрионов на жизнеспособность: первый раз перед пересадкой временному реципиенту и второй раз перед трансплантацией постоянному реципиенту. В зависимости от вида временного реципиента выход морул и бластоцист составляет 23-73%. Более перспективным направлением исследований является получение эмбрионов in vitro на стадии поздней морулы или бластоцисты, пригодных для трансплантации эмбрионов нехирургическим методом в матку коровы -реципиента. Для культивирования эмбрионов in vitro разработаны культу-ральные среды. Установлено, что ранние эмбрионы очень чувствительны к изменениям осмотического давления среды и рН, поэтому для культивирования эмбрионов in vitro применяют хорошо сбалансированные питательные среды: ТС-199, ХЭМ-Ф-10, МРМ, солевые растворы Дюльбекко, Брингстера с различными биологическими и синтетическими добавками. Среду меняют через сутки. Первый контроль за развитием зародыша проводят через 24 ч после оплодотворения. Если оплодотворение прошло нормально, то можно обнаружить второе полярное тельце и борозду дробления.

При питогенетическом и гистологическом анализе выявляют анафазу П, сформированные мужской и женской пронуклеусы, синкарион, первое деление дробления. Сингамия, т.е. вступление в тесный контакт пронук-леусов, в результате чего происходит окончательное слияние мужской и женской гамет, наблюдается через 19 ч после экстракорпорального опло-

дотворения, первый митоз через 21 ч и образование двухклсточного эмбриона через 22 ч.

В стандартных синтетических средах культивирования у большинства эмбрионов на стадиях 8-16 бластомеров наступает блокирование развития, что связано с несовершенством синтетических сред. Предполагают, что этот блок развития ранних эмбрионов можно преодолеть через культивирование эмбрионов на однослойных клеточных популяциях - монослоях.

В качестве таких однослойных клеточных популяций используют монослой яйцевода, гранулезные клетки и клетки трофобласта эмбриона или амниона. В указанных клеточных популяциях предполагается наличие ростстимулирующего фактора, природа и синтез которого изучаются.

 

9. Первые работы в области развития метода культуры изолированных тканей растений относятся к концу XIX и началу XX вв. и связаны с именами таких выдающихся немецких ученых, как H. Vöchting (1892), K. Rechinger (1893) и H. Haberlandt (1902). H. Vöchting (1892) в своих исследованиях сделал попытку установить минимальный размер экспланта. Он выращивал тонкие срезы корня свеклы и одуванчика, сегменты стебля тополя на песке с применением водопроводной воды без стерильных условий. Эти исследования показали, что каллус образуется при толщине среза не менее 1,5 мм. Еще в XIX в. H. Vöchting провел ряд экспериментов, убедительно доказывающих полярность как органов, так и клеток. H. Haberlandt (1902), в свою очередь, впервые высказал идею о возможности культивирования in vitro изолированных клеток растений. Он наблюдал сохранение живыми клеток мезофилла листа в течение нескольких дней. Но для культивирования он выбрал ассимилирующие зеленые клетки – зрелые и высокодифференцированные, утратившие способность к меристематической деятельности. Поэтому результаты его экспериментов оказались отрицательными.

Не достигнув экспериментальных успехов, эти исследователи высказали ряд идей и гипотез, подтвержденных значительно позже. Так, H. Vöchting при изучении полярности пришел к выводу, что она свойственна не только органам растения, но и отдельной клетке. H. Haberlandt выдвинул гипотезу о тотипотентности любой живой клетки.

Длительный период (1902-1922 гг.) исследователи пытались создать подходящую среду и благоприятные условия для выращивания изолированных органов, тканей и клеток. Своей работой они внесли значительный вклад в развитие метода культуры клеток и тканей высших растений (Lamprecht, 1918; Knudson, 1919; Molliard, 1921; и многие другие; цит. по: Бутенко, 1964). Наиболее успешный период в развитии этого метода начался с работ R. Gautheret (1932) и F. White (1931), которые показали способность каллусов и тканей растительных опухолей к неограниченному росту при переносе на свежие питательные среды.

В настоящее время клеточная биотехнология имеет в своем распоряжении ряд методов, основными из которых, помимо культивирования клеток и тканей отдельных растений, являются: 1) методы клонального микроразмножения, включающие индукцию органогенеза и соматического эмбриогенеза; 2) методы изолирования протопластов и получения соматических гибридов; 3) методы получения гаплоидных растений и производных от них дигаплоидов; 4) методы генетической трансформации с последующей регенерацией модифицированных растений.

Основой методов культуры изолированных клеток и тканей растений является уникальное свойство растительных клеток – тотипотентность. Под ним подразумевается способность растительной клетки при определенных условиях вторично дифференцироваться и под влиянием внешних условий выбирать тот или иной путь морфогенеза (Батыгина и др., 1978; Бутенко, 1984; Беккер и др., 1990).

Морфогенез является сложным процессом, регуляция которого осуществляется на клеточном, тканевом и организменном уровнях. В этом процессе участвуют взаимозависимые факторы, определяющие190 процессы деления, растяжения, дифференциации, старения и гибели клеток. В ходе морфогенеза возникают сформированные заново ткани и органы, и соответствующие этому процессы носят названия, отражающие существо морфогенеза - гистогенез, ризогенез, геммогенез (образование листьев или побегов), флоральный геммогенез (образование цветков и (или) отдельных элементов цветка) и соматический эмбриогенез. Полученное в результате морфогенеза in vitro растение носит название растения-регенеранта. В настоящее время при использовании современных методических подходов растение любого вида может быть теоретически регенерировано из каллусной ткани, хотя определилось представление о трудных для регенерации видах и генотипах. Для многих видов растений разработаны несколько методов регенерации.