I. Методы, основанные на изучении фрагментов днк.

1. Плазмидное типирование (рис. 27, 28).При помощи специальных методов из бактерий выделяют плазмидную ДНК и проводят разделение плазмид в агарозном геле. Перед проведением электрофореза плазмидную ДНК можно обработать рестриктазами, что приводит к фрагментированию ДНК. Метод позволяет оценить количество плазмид, их размер, а также характер образуемых рестрикционных фрагментов. Плазмидный анализ широко используется в эпидемиологических исследованиях, особенно при расследовании вспышек заболеваний, вызванных такими микроорганизмами, как Staphylococcus spp., P. aeruginosa, представителями семейства Enterobactereaceae. Однако многие клинические штаммы способны терять плазмиды, особенно в процессе многочисленных пересевов в лаборатории.

	Рис. 27. Рестрикционные профили плазмид, выделяемых у разных штаммов сальмонелл (рестрикция с помощью эндонуклеазы BglII плазмиды blacmy-2 позволяет выявить 9 типов плазмид и распределить сальмонеллы на подтипы)

 

2. Рестрикционно эндонуклеазный анализ (REA). Бактериальную хромосому нарезают рестриктазами на множество фрагментов. Затем проводят электрофорез в пульсирующем электрическом поле, в результате которого фрагменты ДНК выстраиваются в зависимости от размера в шеренгу, образуя уникальный видоспецифический профиль (рис. 29).

Рис. 29. Рестрикционно эндонуклеазный анализ ДНК Staphylococcus spp.

По сходству рестрикционных профилей изучаемого и известных видов микроорганизмов можно идентифицировать и типировать микроорганизмы. Обычно для рестрикции используют макрорестриктазы – ферменты, распознающие участки, состоящие из 6 или более нуклеотидов (табл. 12). Такие участки распознавания присутствуют в геноме в небольшом количестве, поэтому в результате действия макрорестриктаз образуется до 30 достаточно крупных фрагментов. С помощью данного метода анализируется около 90% бактериальной хромосомы. С помощью компьютеризированной системы сканирования гелей могут быть созданы базы данных ретрикционных профилей для многих микроорганизмов.

Таблица 12

Примеры некоторых рестриктаз и их рестрикционных сайтов

Типы рестриктаз	Рестриктаза	Сайт распознавания
Макрорестриктазы, распознающие последовательности из 6 и более нуклеотидов	SmaI	5'...C C C^G G G...3' 3'...G G G^C C C...5'
SalI	5'...G^T C G A C...3' 3'...C A G C T^G...5'
XbaI	5'...T^C T A G A...3' 3'...A G A T C^T...5'
Стандартные рестриктазы	HaeIII (BsuRI)	5'...G G^C C...3' 3'...C C^G G...5'

Примечание. ^ - место рестрикции.

II. Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот.

Молекулярная гибридизация - м олекулярно-биологическая техника, основанная на способности одноцепочечной молекулы изучаемой ДНК/РНК специфически соединяться с комплементарными одноцепочечными зондами (молекулами-свидетелями) с образованием гибридных дуплексов, которые флюоресцируют или меняют цвет реакционной смеси.

Методы молекулярной гибридизации позволяют в ыявлять степень сходства двух молекул ДНК, что используется для эволюционного анализа, для идентификации и типирования микроорганизмов, а также для изучения экспрессии генов.

Варианты проведения молекулярной гибридизации.

1. В растворе.

2. В тканевых срезах (in situ). Тканевые срезы депарафинируют, демаскируют нуклеиновые кислоты в них и наносят гибридизационный раствор, содержащий специфические меченые зонды. Проводят денатурацию ДНК, гибридизацию, отмывку несвязавшихся зондов, после чего осуществляют детекцию гибридизировавшихся зондов по флюоресценции.

3. На микрочипах (эррей гибридизация) – наиболее совершенный метод. Позволяет наносить и фиксировать до нескольких сотен тысяч ДНК-зондов на поверхность стеклянного чипа, что дает возможность изучать одновременно все гены, присутствующие в ДНК микроорганизма.

4. На мембранах. Изучаемую ДНК фиксируют на мембранах и к ней добавляют гибридизационный раствор, содержащий специфические меченые зонды. В случае комплементарности зонд связывается с ДНК, после отмывки несвязавшихся зондов регистрируют флюоресценцию.

Этапы реакции гибридизации на мембранах:

А. Выделение ДНК. Методы аналогичны методам выделения ДНК для проведения ПЦР.

Б. Получение мелких фрагментов изучаемой ДНК(не более 5000 – 10000 п. о.). Для этого проводят либо рестрикцию (нарезку рестриктазами) крупной молекулы ДНК, либо ПЦР с образованием небольших ампликонов, либо обработку ультразвуком.

В. Нанесение ДНК на мембрану и фиксация ДНК на мембране:

– дот-блоты или слот-блоты.Перед нанесением ДНК денатурируют – превращают в одноцепочечные молекулы. Затем небольшие фрагменты изучаемой ДНК наносят на мембрану в виде точек (дот-блоты), либо полосок (слот-блоты).

– саузерн-блоты.Небольшие фрагменты изучаемой ДНК предварительно разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле. ДНК переносят из геля на поверхность мембран.

Перенесенную на мембрану ДНК фиксируют при 80⁰С или УФ светом.

Г. Гибридизацияпроводится в несколько этапов:

– обработка предгибридизационным буфером мембраны с ДНК, что увеличивает связывающую способность мембраны;

– приготовление гибридизационного раствора, содержащего буфер и меченый зонд;

– программирование гибридизационной камеры и проведение гибридизации при 65⁰С.

Д. Анализ результатов. Если зонд комплементарен одноцепочечному участку ДНК изучаемого микроорганизма, происходит связывание зонда и исследуемой ДНК. Некомплементарные несвязавшиеся зонды удаляют промыванием. В месте связывания зонда выявляют флюоресценцию или изменение цвета (рис. 30).

 

Рис. 30. Схема реакции молекулярной гибридизации для обнаружения в образцах ДНК возбудителя специфическим меченным зондом