Чувствительности бактерий к антибиотикам

Эмпирическое назначение антибиотиков основано на знаниях о природной чувствительности бактерий к антибиотикам, эпидемиологических данных о резистентности микроорганизмов в регионе или стационаре. Несомненным преимуществом эмпирической антимикробной терапии является незамедлительное начало ее проведения.

Однако из-за формирования резистентности у микроорганизмов этиотропная антибиотикотерапия может быть неэффективной. Поэтому важно проводить э тиотропное назначение антибиотиков, основанное навыделении возбудителя инфекции из клинического материала и определении его чувствительности к антибиотикам (табл. 16).

Определение антибиотикорезистентности проводят согласно утвержденным документам – стандартам или приказам, которые регламентируют процедуру определения антибиотикорезистентности микроорганизмов. В РБ существует приказ Министерства здравоохранения по определению антибиотикорезистентности, в Америке и Европе – стандарты Комитета по клиническим лабораторным стандартам (NCCLS).

Таблица 16

Классификация методов определения

чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Критерий метода	Методы
1. Подход	Генотипические: ПЦР ПЦР-ПДРФ ДНК - гибридизация секвенирование
Фенотипические: диффузионные методы (диско-диффузионный) методы разведений (в агаре, в бульоне) комбинированные (Е-тест)
2. Быстрота получения результатов	Ординарные (обычные)
Ускоренные
Автоматизированные

Основные понятия

(МИК) - минимальная ингибирующая (подавляющая) концентрация -наименьшая концентрация антибиотика,которая подавляет видимый рост исследуемого микроорганизма in vitro (в бульонных или на агаровых питательных средах) в стандартных условиях постановки опыта и выражается в мкг/мл (мг/л) или ед/мл.

Минимальная бактерицидная концентрация (МБК)- наименьшая концентрация антибиотика, которая при исследовании in vitro вызывает гибель 99,9% микроорганизмов от исходного уровня в течение определённого периода времени.

Чувствительный микроорганизм - штамм микроорганизма, который не имеет механизмов резистентности к данному препарату. Его его на питательной среде прекращается при использовании антибиотика в терапевтической дозе.

Умеренно-резистентный микроорганизм - штамм микроорганизма, рост которого на питательной среде прекращается только при использовании антибиотика в высшей дозе. Лечение инфекций, вызываемых умеренно-резистентными микроорганизмами, проводится при отсутствии альтернативных препаратов, высшей (максимальной терапевтической) дозой антибиотика.

Резистентный микроорганизм - штамм микроорганизма, который имеет механизмы резистентности к данному препарату. Его рост на питательной среде прекращается лишь при использовании очень высоких концентраций препарата, которые нельзя создать в организме из-за их высокой токсичности. При лечении инфекций, вызванных этим микроорганизмом, клинический эффект от терапии отсутствует даже при использовании высшей дозы антибиотика. При этом могут наблюдаться побочные действия антибиотика.

Показания к определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам:

1) определение чувствительности к новому антибиотику, рекомендуемому к применению;

2) периодический мониторинг антибиотикорезистентности в отдельных медицинских центрах и в различных географических регионах с целью наблюдения за распространием антибиотикорезистентности;

3) обоснование адекватной антибиотикотерапии у отдельных больных в случаях:

а) выделения микроорганизмов из первично стерильных жидкостей, орга­нов и тканей человека;

б) при выделении микроорганизмов из первично нестерильных биотопов, оценке чувствительности должна предшествовать оценка клинической значимости выделенного микроорганизма;

в) инфекций, резистентных к препаратам эмпирической терапии;

г) уникальных инфекций и отсутствии опыта их терапии;

д) инфекций, требующих пролонгированной терапии (каждую неделю терапии проводят детекцию антибиотикорезистености, так как возможна смена возбудителей).

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам нецелесообразно:

1) для предста­вителей нормальной микрофлоры человека, при их выделении из естественных мест обитания;

2) для видов микроорганизмов, у которых не описано резистентных форм к тем или иным антибиотикам. Например, Streptococcus pyogenes чувст­вительны к пенициллину, поэтому проводить определение чувствительности к этим препаратам в повседнев­ной практике нецелесообразно.

Выбор антибиотиков, подлежащих тестированию.

В исследования включают антибиотики, обладающие природной активностью в отношении выделенных микроорганизмов с клинически подтвержденной эффективностью при соответствующих инфекциях.

В перечень антибиотиков могут быть включены 1 - 2 дополнительных препарата по запросу лечащего врача, либо при появлении новых более эффективных средств.

Этапы тестирования чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

1. Выделение чистой культуры микроорганизмов и приготовление суспензии микроорганизмов. Прямое определение чувствительности без выде­ления чистой культуры возможно только в исклю­чительных случаях, при этом исследова­ние следует повторить после выделения чистой культуры микроорганизма.

2. Приготовление среды.

3. Инокуляция среды микроорганизмами.

4. Инкубация.

5. Учет результатов, анализ, формулирование рекомендаций по лечению.

6. Периодический контроль качества тестирования с использованием штаммов из международных коллекций микроорганизмов.

Диско-диффузионный метод

Характеристика метода. Полуколичественный. Определяет группы антибиотиков, активных в отношении патогена.

Особенности метода. Используют стандартные диски диаметром 6,25 мм, представляющие собой фильтровальный картон, пропитанный антибиотиком в определенной концентрации.

Техника проведения. Готовят суспензию тест-микроорганизмов в концентрации 1,5х10⁸ КОЕ/мл, наносят ее в объеме 1 мл на чашку Петри со средой агар Мюллер-Хинтона или АГВ (толщина слоя среды 4±0,5 см). Суспензию распределяют равномерно по поверхности, избыток суспензии удаляют, поверхность среды высушивают, наносят на среду диски на расстоянии 2 см друг от друга и от края, но не более 6 на чашку Петри, инкубируют при 35⁰С 18–24 часа. Можно использовать специальный диспенсер для одновременного нанесения 6 дисков.

Принцип учета. Антибиотик из диска центробежно диффундирует в среду, в месте его действия микроорганизмы погибают, образуя концентрическую зону задержки роста. В остальных участках среды микроорганизмы беспрепятственно растут.

Оценка чувствительности. Определяют диаметр зон задержки роста в мм и сравнивают со стандартными величинами зон задержки роста, на основании чего относят микроорганизмы к чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным (рис. 45).

Оценка метода. Простой, нетрудоемкий, относительно дешевый, обладает высокой воспроизводимостью. Основной метод в клинических лабораториях для нетребовательных микроорганизмов.

Метод разведений в агаре

Характеристика метода. Количественный. Определяет активные препараты и их ингибирующие концентрации.

Особенности метода. Готовят 8 - 12 серийных двукратных разведений антибиотика в агаре Мюллер-Хинтона.

Техника проведения. Готовят суспензию тест-микроорганизмов в концентрации 10⁷ КОЕ/мл и инокулируют по 1 - 2 мкл (посевная доза 1 - 2х10⁴) на среды в чашках Петри с последовательными двукратными концентрациями антибиотика, инкубируют при 35⁰С 18–24 часа. Культуры могут наносить на среду в чашках Петри штампом-репликатором, что позволяет одновременно изучать до 100 культур.

Принцип учета. Микроорганизмы растут на среде, если концентрация антибиотика ниже ингибирующей и не растут - если больше.

Оценка чувствительности. Определяют МИК антибиотика для тест-культуры и сравнивают со стандартными величинами МИК. Относят тест-культуру к чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным.

Оценка метода. Метод трудоемкий, требует затрат большого количества сред, посуды, времени. Основной метод регионального или национального мониторинга антибиотикорезистнтности.