IV. Методы анализа амплифицированных фрагментов.

Анализ амплифицированных фрагментов позволяет:

1) идентифицировать микроорганизмы;

2) выявлять подтипы микроорганизмов одного вида;

3) выявлять мутации в ДНК.

Внутривидовое типирование особенно важно при проведении эпидемиологических исследований. По сравнению с традиционными фенотипическими методами, генотипирование на основе ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем дифференциации, возможностью использования количественных методов для оценки идентичности штаммов.

1. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ, англ. - RFLP). Используя ПЦР, амплифицируют определенный генетический локус. Далее продукт амплификации расщепляют рестрикционными эндонуклеазами. При этом образуются фрагменты различного размера, которые при проведении электрофореза образуют профили, различные у разных видов (вариантов) микроорганизмов.

2. Полиморфизм длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ, англ. – AFLP). В отличие от предыдущего метода рестрикцию проводят до ПЦР. ДНК тест-микроорганизма с использованием рестриктазы нарезают на фрагменты, затем проводят ПЦР.В результате образуются фрагменты различного размера, которые при проведении электрофореза образуют профили, различные у разных видов (вариантов) микроорганизмов.

3. Полиморфизм конформации однонитевой ДНК (ПЦР-SSCP). Используют для выявления точечных мутаций в ДНК. Проводят ассиметричную ПЦР, что сопровождается накоплением однонитевых молекул ДНК, которые разделяют при помощи электрофореза в денатурирующем геле, позволяющем разделять фрагменты, отличающиеся друг от друга одним нуклеотидом.

 

V. Методы, основанные на определении последовательности нуклеотидов в ДНК, РНК и аминокислот в белках.

Секвенирование – метод, позволяющий определять последовательность нуклеотидов – аденина, тимина, гуанина, цитозина – в молекуле ДНК. Использование этого метода расширило возможности биологии и позволило секвенировать геномы человека, животных, растений, микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов).

Цели секвенирования:

1) расшифровка генома – определение количества генов, их протяжённости, локализации, функций;

2) идентификация неизвестных микроорганизмов путем сравнения нуклеотидной структуры некоторых их генов с соответствующими последовательностями известных видов;

3) определение мутаций в генах для выявления резистентных микроорганизмов и изучения молекулярных механизмов устойчивости;

4) эпидемиологические исследования (определение генетических различий штаммов одного вида, выделяемых в разное время и из разных источников, что необходимо для определения связей между циркулирующими в различных регионах и стационарах микроорганизмов). Важны для выявления источников и механизмов распространения микроорганизмов, а также механизмов развития эпидемий;

5) выявления направлений эволюции микроорганизмов. На основании секвенированных последовательностей строят дендрограммы, позволяющие оценивать сходство микроорганизмов и их происхождение.

Этапы секвенирования.

1. Проведение ПЦР. Позволяет получить множественные копии небольших фрагментов ДНК размером от 300 до 1000 нуклеотидов. Секвенирование больших фрагментов затруднено, так как при проведении их электрофореза невозможно выявить фрагменты, отличающиеся в один нуклеотид.

2. Очистка амплифицированных фрагментов ДНК. Проводят очистку ампликонов от шлаков – остатков ПЦР реакции (праймеров, несвязавшихся нуклеотидов).

3. Секвенирование. Проводят ряд последовательных стадий (рис. 38):

а) приготовление реакционной смеси, которая содержит:

- изучаемую ДНК,

- праймер,

- ДНК-полимеразу и буфер для неё,

- дезоксинуклеотидтрифосфаты (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ),

- меченые флюоресцентной меткой дидезоксинуклеотиды, которые обрывают синтез цепочки ДНК, так как лишены 3'-OH группы, необходимой для образования мостика между двумя нуклеотидами;

б) проведение реакции ПЦР-секвенирования;

Рис. 38. Этапы секвенирования

	1. С помощью ПЦР получают множественные копии изучаемого гена, размер которых не должен превышать 1000 п. о. Образуемые в ПЦР ампликоны выявляют электрофорезом. 2. Ампликоны очищают от ПЦР-шлаков (праймеров, нуклеотидов).

	3а, б. С помощью флуоресцентно меченых терминаторов синтеза ДНК-цепи, получают множество фрагментов ДНК, синтез которых оборван на аденине, тимине, гуанине, цитозине. Количество получаемых фрагментов ДНК равно сумме А, Т, Г, Ц, присутствующих в секвенируемом фрагменте.   3в. Проводят электрофорез в денатурирующем полиакриламидном геле, в котором разделяются фрагменты ДНК, отличающиеся в один нуклеотид.
		А Ц Г Т А Ц Г Т 1 1 1 1 2 2 2 2 Образец 1 Образец 2

Кодоны 507 508 509 510 511 512 513 514 515 516 517 518 519 520 521 522 523 524 525 526 527 528 529

H37RV GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA

455 GGC ACG AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC GAC AAG CGC CGA

443 GGC ACC AGC GAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC GAC AAG CGC CGA

Первичная структура секвенированного rpoB гена у контрольного штамма Mycobacterium tuberculosis H37RV и МБТ, выделенных у больных с множественно резистентным туберклезом. у штамма 455 видны мутации в кодоне 508 и 526, у штамма 443 - в кодоне 510 и 526 rpoB гена. Эти мутации в rpoB гене являются причиной устойчивости возбудителей туберкулеза к рифампицину.

 

3г. Результатом секвенирования являетсялинейное символьное описание атомной структуры молекулы ДНК, или первичная структура ДНК.

Сравнение секвенированного фрагмента ДНК с международным банком геномов с помощью программы BLAST позволило идентифицировать фрагмент как rpoB Mycobacterium tuberculosis.

 

4. Первичную структуру секвенированного фрагмента ДНК идентифицируют с использованием программы BLAST, доступ к которой открыт через сервер http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/.

в) электрофорез в денатурирующем полиакриламидном геле для разделения ампликонов, отличающихся размерами в один нуклеотид;

г) получение линейного символьного описания атомной структуры молекулы ДНК.

4. Биоанализ первичной структуры ДНК с помощью компьютерных программ для получения необходимой информации.

Недостатки секвенирования:

1) позволяет секвенировать фрагменты размером 300 – 1000 нуклеотидов, при этом первые 15–40 и последние 700–900 нуклеотидов распознаются плохо;

2) методы секвенирования ДНК пока недоступны для практических лабораторий, так как требуют дорогостоящего оборудования, дорогостоящих реагентов.

Другие варианты секвенирования.

Крупномасштабное секвенирование, позволяющее секвенировать большие фрагменты ДНК, например, целую хромосому микроорганизмов. ДНК нарезают на фрагменты при помощи рестриктаз. Эти небольшие фрагменты при помощи вектора переносят в Escherichia coli (клонируют). Микроорганизмы, размножаясь приводят к накоплению клонированной ДНК (клональная амплификация). Далее все разновидности клонированных фрагментов ДНК секвенируют и при помощи компьютера собирают в единую длинную цепочку. Такой подход не требует предварительной информации об изучаемой ДНК, поэтому относится к секвенированию de novo.

Секвенирование с использованием гибридизации. В его основу положены гибридизационные биочиповые технологии. При этом неизвестная ДНК обрабатывается флюоресцентным красителем и наносится на чип с большим количеством зондов разной специфичности, находящихся в разных участках чипа. Тот участок чипа, где отмечается сильная флюоресценция, свидетельствует о комплементарности зонда и изучаемой ДНК, что позволяет идентифицировать ДНК, зная характер зонда.

Микрожидкостное секвенирование по Сенджеру. Проводится с использованием всех стадий секвенирования по Сенджеру: ПЦР, очистки продуктов амплификации, электрофореза. Реакция осуществляют в специальных чипах, при этом объем реакции измеряется в нанолитриах, что способствует меньшему расходу дорогостоящих реагентов. Чип состоит из трех функциональных частей: 1) камеры для ПЦР; 2) камеры для очистки ампликонов; 3) камеры для капиллярного электрофореза (капилляр имеет длину 30 см и компактно скручен).