Сложные методы окраски клеточных структур бактерий

Структура бактерий	Метод окраски	Вид препарата
Споры	по Ожешко	споры – красные, вегетативные клетки – синие
Капсула	по Бурри-Гинсу	бесцветная капсула вокруг красного микроба, фон окрашивается в цвет туши
Клеточная стенка	у некислотоустойчивых – по Граму	грам+ – фиолетовые, грам- – красные
у кислотоустойчивых (микобактерий) – по Цилю-Нильсену	кислотоустойчивые – красные, некислотоустойчивые – синие
Жгутики	по Морозову	клетки – тёмно-коричневые, жгутики – светло-жёлтые
Нуклеоид	по Романовскому-Гимзе	нуклеоид – фиолетовый, цитоплазма – бледно-розовая
Включения	по Нейссеру	палочки – желтые, зерна волютина – синие

Сложный метод окраски по Романовскому-Гимза используют для окрашивания простейших, спирохет, ядерных элементов.

Сухие мазки фиксируют в метиловом спирте (5 мин) или в смеси Никифорова (15 мин), погружают в рабочий раствор (разведение 1:4) краски Романовского-Гимза (состоит из азура, эозина и метиленовой синьки) на 5-7 мин, промывают дистиллированной водой и высушивают. Каждая новая партия красителя требует отработки своего режима окраски, даже если они применяются для одного и того же биоматериала. Краситель можно использовать неоднократно, соблюдая условия хранения.

При окраске по Романовскому-Гимза цитоплазма простейших голубая, ядра красные. Боррелии сине-фиолетовые, трепонемы и лептоспиры слабо-розовые.

Правильно окрашенный по Романовскому-Гимза мазок крови имеет светло-розовую окраску; эритроциты розовые; ядра лейкоцитов фиолетово-красного цвета с хорошо видимой структурой хроматина, хорошо выделяются ядрышки; цитоплазма нейтрофилов светло-розовая; базофильная зернистость синяя, эозинофильная - красная, нейтрофильная – сиреневая, зернистость моноцитов - нежная азурофильная.

3 этап БСМИ. Микроскопия с оценкой формы, размеров, взаимного расположения микробов. Микроскоп (греч. skopeo – смотрю) – оптический прибор для получения увеличенных изображений объектов, не видимых невооружённым глазом. Различают световую (светлопольную, иммерсионную, темнопольную, фазово-контрастную, люминесцентную) и электронную микроскопию.

Светлопольная микроскопия – основной метод исследования клеток и тканей, в котором для освещения объекта используют лучи видимого спектра.

 

Рис.1. Устройство светового микроскопа

Световой микроскоп (рис. 1) имеет механическую систему и оптическую систему (объектив, окуляр, осветительное устройство). Объективы по способу использования и степени увеличения делятся на сухие - между объективом и рассматриваемым предметом находится воздух и иммерсионные (лат. immersio – погружение) – между объективом и рассматриваемым предметом находится жидкость.

Светлопольная микроскопия предназначена для изучения окрашенных препаратов. Изображение создается за счёт различий в степени поглощения света разными участками исследуемого окрашенного объекта (рис. 2). При прохождении пучка света через окрашенный препарат происходит изменение интенсивности света, т. е. меняется амплитуда световой волны. Такие амплитудные изменения легко улавливаются человеческим глазом.

Возможно применение светлопольной микроскопии и при наблюдении неокрашенных нативных препаратов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив.

 

Рис. 2. Схема светового микроскопа для наблюдения в светлом поле зрения

 

При использовании сухого объектива с большим фокусными расстоянием световые лучи, идущие от зеркала через конденсор в объектив, проходят через неоднородные среды, различающиеся показателями преломления. Часть лучей отклоняется и не попадает в объектив. В результате поле зрения освещено недостаточно. Обычная световая микроскопия с сухим объективом, имеющим слабое увеличение, в микробиологии используется редко – для изучения микроорганизмов, имеющих крупные размеры (более 10 мкм).

Чтобы увеличить разрешающую способность микроскопа и исследовать более мелкие микроорганизмы, используют иммерсионную микроскопию. Иммерсионный объектив с фокусным расстоянием 1,5–3 мм (маркирован «ОИ» («ИО») или «МИ» («ИМ»), имеет кольцевую чёрную или белую черту) погружают в каплю масла (кедрового, персикового, при их отсутствии – вазелинового), показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла.

Иммерсионное масло устраняет потери попадающих в объектив лучей

света вследствие своего одинакового со стеклом коэффициента преломления (рис. 3). В этом случае падающий на препарат пучок света не рассеивается и, не меняя направления, попадает в иммерсионный объектив; разрешающая способность микроскопа увеличивается.

Иногда вторую каплю иммерсионной жидкости помещают на верхнюю линзу конденсора. В редких случаях используют водную иммерсию, в этом случае устанавливают объектив «ВИ».

Рис. 3. Схема хода лучей в сухой и иммерсионной системах

Увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. Сухие объективы могут иметь увеличение 8, 10, 20, 40, иммерсионные – 90, 100. Окуляры могут иметь увеличение 7, 10, 12, 15. Обычный световой микроскоп даёт увеличение в 100–400 раз, иммерсионный – в 1000 раз.

Качество микроскопа зависит не от степени увеличения, а от его разрешающей способности – минимального расстояния между двумя точками, которое ещё можно различить. Невооружённый человеческий глаз имеет разрешающую способность около 100 мкм. Разрешающая способность светового микроскопа ограничена длиной световых волн. В световых микроскопах с иммерсионной системой при использовании видимой части дневного света можно рассмотреть объекты около 0,2 мкм. Размеры микроорганизмов, имеющих клеточное строение, составляют 0,2–20 мкм (чаще 0,5–10 мкм) и они легко обнаруживаются в иммерсионном микроскопе.

Структуру препарата можно различить лишь тогда, когда разные его частицы по-разному поглощают или отражают свет либо отличаются одна от другой (или от окружающей среды) показателем преломления. Эти свойства обусловливают контрастность изображения – различие яркостей изображения и фона. Если это различие составляет менее 3–4 %, то его невозможно уловить.

 

Другие методы световой микроскопиивыбираются в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов.

Темнопольная микроскопия (ТПМ) – микроскопия с боковым освещением (ультрамикроскопия), позволяет обнаружить частицы размером в несколько миллимикронов, которые не видны в светлопольном микроскопе.

Принцип ТПМ. Микроскопия в тёмном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля).

Эффект тёмного поля создаётся с помощью специального темнопольного конденсора, имеющего боковую зеркальную поверхность или обычного конденсора, между линзами которого вкладывают кружок чёрной фотобумаги так, чтобы незначительная периферическая часть линзы оставалась свободной.

При выходе из темнопольного конденсора основная часть лучей света не попадает в объектив. Изображение в микроскопе формируется при помощи небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата и прошедшими через объектив (рис. 4).

Рис. 4. Ход лучей в темнопольном микроскопе

 

При микроскопии препарата в тёмном поле зрения на верхнюю линзу конденсора наносят каплю масла, помещают препарат с предметным стеклом, на которое наносят каплю масла. Наносить масло на обе поверхности необходимо, чтобы при иммерсионной микроскопии проходящие лучи света не преломлялись. Можно использовать и сухую систему (объектив х40) и помещать каплю масла только на верхнюю линзу конденсора. Так как для бокового освещения необходим параллельный пучок света, применяется только плоское зеркало. Вместо масла можно использовать дистиллированную воду.

В темнопольном микроскопе в нативных препаратах изучают живых неокрашенных микроорганизмов, напр., спирохет (рис. 5).

Прямые лучи освещают объект не снизу, а сбоку и не попадают в глаза наблюдателя. В объектив попадают лучи, отражённые исследуемым объектом. Неосвещённое поле зрения остаётся совершенно тёмным, а микроорганизмы, отражающие лучи света, выглядят ярко светящимися.

Рис. 5. Treponema pallidum в темнопольном микроскопе

Фазовоконтрастная (ФКМ) микроскопия позволяет исследовать нативные препараты: бесцветные, прозрачные объекты, детали строения которых оптически мало различаются (живые клетки, срезы тканей, микоплазмы).

При ФКМ используют дополнительное фазово-контрастное устройство, состоящее из фазового объектива и фазового конденсора.

Фазовый объектив внутри имеет фазовую пластинку с нанесенным кольцом, которое изменяет фазу и уменьшает амплитуду световой волны. Середина кольца составляет 1/2–2/3 от диаметра выходного зрачка объектива, светопропускание кольца – 10–30% в зависимости от типа фазового контраста.

Фазовый конденсор имеет кольцевую диафрагму с прозрачным световым кольцом. Размер светового кольца подбирается так, чтобы он соответствовал (или был чуть меньше) размеру фазового кольца объектива.

Изображение кольцевой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пластинки соответствующего объектива.

Принцип ФКМ. Человеческий глаз хорошо определяет изменения интенсивности света, наступающие при прохождении через окрашенные препараты, когда меняется амплитуда колебаний света. Распространение же световых волн в прозрачных однородных объектах не сопровождается потерей интенсивности света. Меняется только скорость прохождения света через объект по сравнению со скоростью его распространения в окружающей среде. Эти изменения называются фазовыми, так как при этом изменяется фаза колебаний прошедшего света. Фазовые колебания света глаз не воспринимает, а наблюдаемые объекты выглядят малоконтрастными, прозрачными.

Пучок света, проходя через кольцевую щель диафрагмы и объект, попадает в кольцо фазовой пластинки объектива. Лучи света отклоняются от фазовой пластинки (рис. 6). В результате между лучами, прошедшими через объект, и лучами светового фона возникает разность длины волны.

Таким образом, при использовании фазово-контрастного устройства невидимые фазовые изменения преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения интенсивности (яркости) света, которые различимы глазом.

Рис. 6. Ход лучей в фазово-контрастном микроскопе

Получаемое изображение называется фазово-контрастным.

В зависимости от способа получения фазовых колец различают 2 типа фазового контраста:

а) позитивный фазовый контраст, когда фазовое кольцо в объективе технологически получается путем травления, что вносит «опережение» в прямо прошедший свет.

При этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, получается темнее на более светлом фоне (рис. 7). Лучшие результаты наблюдаются при позитивном фазовом контрасте.

Рис. 7. Фазово-контрастная микроскопия Bacillus cereus (позитивный фазовый контраст)

б) негативный (аноптральный) фазовый контраст, когда фазовое кольцо в объективе технологически получается путем нанесения на поверхность стекла тонкой пленки из копоти или меди, поглощающей не менее 10% света. Это вносит «запаздывание» в прямо прошедший свет. При этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, выглядит светлее окружающего темного фона. Аноптральная микроскопия позволяет достичь большей чёткости изображения малоконтрастных живых микроорганизмов.

ФКМпозволяет получить изображения малых прозрачных и бесцветных живых объектов (микроорганизмов, клеток).

Крупные прозрачные объекты рассеивают лучи света на небольшие углы, эти лучи проходят вместе с не отклонёнными через фазовое кольцо. Для крупных объектов фазово-контрастный эффект имеет место только вблизи их контуров, где происходит сильное рассеяние.

Люминесцентная микроскопия. Ее п ринцип основан на использовании явления люминесценции (флюоресценции, холодного свечения) – способности некоторых веществ флюоресцировать, т. е. на доли секунд поглощать падающие на них УФ или коротковолновые (сине-фиолетовые) лучи, а затем снова испускать свет. Испускаемый свет имеет длину волны, превышающую длину волны поглощаемого света на 20–50 нм, т. е. смещен по длине волны в сторону длинноволновой области спектра. Так, например, если поглощается синий свет, то испускается зеленый свет. Зеленый свет преобразуется в желтый, желтый – в красно-оранжевый, а невидимое УФ- излучение – в видимый свет. Такое явление носит название «эффект Стокса».

Первичная (собственная) люминесценция наблюдает­ся без предварительного окрашивания объекта. Вторичная (наведенная) возникает после окраски препаратов специаль­ными люминесцирующими красителями – флюорохромами (акридиновым оранжевым – используют для обнаружения гонококков, аурамином – микобактерий, корифосфином – коринебактерий, ФИТЦ (флюоресцеина изотиоцианатом) – для метки антител).

Основной частью люминесцентного микроскопа является осветитель, имеющий лампу ультрафиолетового цвета, и систему фильтров (рис. 8).

Рис. 8. Схематическое изображение люминесцентного микроскопа

Галогенные лампы непригодны в качестве источника света для люминесцентных исследований, так как металлическая нить накаливания преобразует большую часть потребленной электроэнергии в красный или невидимый инфракрасный свет. При этом лампа имеет непрерывный спектр излучения в широком спектральном диапазоне, непригодный для наблюдения слабосветящихся объектов.

Для работы в свете люминесценции необходим источник света с линейчатым спектром, интенсивным в коротковолновой части. Таким спектром излучения обладают ртутные лампы, работающие по принципу газового разряда. Лампы имеют специфичное светящееся тело. В кварцевую колбу вплавлены два электрода. В зоне горения содержится небольшое количество ртути. За счет разрядов определенной мощности высокого напряжения между электродами возникает электрическая световая дуга, которая поддерживается в «горящем» состоянии.

Ртутная лампа излучает интенсивный свет, содержащий значительную долю УФ-излучения, которое необходимо для наблюдения в свете люминесценции.

В оптическую схему люминесцентного микроскопа вводят два светофильтра. Между зеркалом микроскопа и источником света устанавливают сине-фиолетовый светофильтр. Он пропускает от источника-осветителя только сине-зелёный свет, возбуждающий люминесценцию. Вещества-флюорохромы поглощают падающие на них коротковолновые лучи, переходят в возбуждённое состояние и приобретают иной цвет. Обратный переход в нормальное состояние происходит с испусканием света с большей длиной волны. Сине-зелёный свет мешает видеть возбуждаемое им свечение препарата, поэтому по пути к глазу наблюдателя отсекается жёлтым светофильтром.

Люминесцирующие объекты светятся ярким светом в тёмном поле зрения (рис. 9, 10). Сила их света чаще невелика, поэтому люминесцентную микроскопию проводят в затемнённом помещении.

Рис. 9. Micobacterium tuberculosis (желтые) в люминесцентном микроскопе

Рис. 10. Escherichia coli (синие – живые, красные – погибшие) в люминесцентном микроскопе

Преимущества люминесцентной микроскопии:

· цветное светящееся изображение микроорганизмов на чёрном фоне;

· обнаружение и установление локализации и концентрации живых и погибших микроорганизмов;

· возможность обнаружения микроорганизмов в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой степени контрастности изображения;

· при использовании коротких УФ лучей разрешающая способность люминесцентного микроскопа увеличивается до 0,1мкм;

· экспресс-идентификация антигенов микроорганизмов в РИФ;

· возможность исследования прозрачных и непрозрачных объектов;

· возможность исследования жизненных процессов в динамике;

· использование люминесцентной микроскопии при цитологических и гистохимических исследованиях, так как флюорохромы могут распределяться в клетке диффузно либо избирательно окрашивать отдельные клеточные структуры или определенные химические соединения биологического объекта.

Возможности оптических микроскопов ограничены слишком большой длиной волны видимого света (6000 А). Объекты, размеры которых меньше этой величины, находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа и могут быть обнаружены только при электронной микроскопии.

Электронная микроскопия (ЭМ) предполагает использование электронного микроскопа (рис. 11), в котором для освещения объектов вместо светового пучка используются электронные лучи (поток электронов).

Целые клетки из-за своей большой толщины непрозрачны для пучка электронов. Поэтому ЭМ требует специальной подготовки объектов исследования. Материал после фиксации обезвоживают, заливают в эпоксидные смолы, режут стеклянными или алмазными ножами на специальных ультратомах, позволяющих получать ультратонкие срезы толщиной 30–50 нм.

Биологические объекты состоят из веществ, построенных из лёгких элементов (С, N, О, Н, Р, S), поэтому их изображение в электронном микроскопе слабо контрастно и в клетках можно увидеть очень мало структурных деталей. Чтобы сделать изображение более контрастным, клетки обрабатывают электронными красителями – солями тяжёлых металлов (свинца, ртути, хрома, урана, вольфрама). Так как атомы тяжёлых металлов очень сильно рассеивают электроны, то структуры клетки, поглотившие эти металлы, будут выглядеть тёмными и контрастными. В качестве индикаторов для окислительно-восстановительных ферментов в ЭМ используют теллурит калия или соли тетразолия. Эти соединения, проникая в клетки, акцептируют электроны, которые они получают от дегидрогеназ. В результате реакции эти соединения восстанавливаются и выпадают в осадок, имеющий вид электронно-плотных (тёмных на экране микроскопа) зёрнышек, глыбок, слоёв.

Таблица 3