Особенности культивирования биол. объектов: основные параметры роста культур.

Установка для культивирования живых организмов содержит камеру, представляющую собой эластичную емкость, укрепленную на наклонном жестком каркасе и разделенную на отсеки - питательный, ростовой, промежуточный и приемный. Отсеки разделены прижимными элементами, промежуточный и приемный отсеки выполнены с возможностью герметизации, между питательным и ростовым отсеками размещена встроенная прокладка из пористого материала. Приемный и промежуточный отсеки имеют раздельный газообмен, а ростовой и приемный отсеки соединены трубопроводом с насосом. Изобретение относится к биологической промышленности, а именно к установкам для промышленного культивирования каллусных культур растений и базидальных грибов, например, плодовых тел грибов полипорус или культуры клеток женьшеня. Цель изобретения - повышение эффективности работы установки при сохранении ее стерильности.

Питательные среды - среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения микроорганизмов, их культивирования и сохранения в лабораторных или промышленных условиях. (По составу: натуральные, синтетические и полусинтетические; По консистенции: жидкими, полужидкими, твердыми, сыпучими)

Культивирование аэробных - на поверхности плотных сред или в на поверхности плотных сред или в жидкости, и анаэробных микроорганизмов - культивирование в микроанаэростате - вакуумном аппарате, Использование химических веществ, поглощающих молекулярный кислород (металлическое железо), Использование восстанавливающих агентов (аскорбиновая кислота), выращивание в высоком слое среды;выращивание в толще плотной среды; культивирование в вязких средах

Методы колич. учета микроорг-в: прямого подсчета к-к под микроскопом, путем высева на пит.среды (чашечный м-д Коха). Сущность - в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорг-в на агаризованную пит. среду в чашках Петри и подсчете формирующихся колоний, зная, что кажд. колония - потомство одной жизнеспособ. к-ки.

 

 

30.Техника культивирования изолированных кл. и тк.растений.Реализация тотипотентности. состав питательных сред: А.соли макроэлементов (азота,др); Б.соли микроэлем. (бора,др); В.источники углерода (сахароза конц.2-3%); Г.фитогормоны; Д.органические добавки и витамины; Е. различные добавки. Неорганич. соли (макро- и микросоли) явл.осн. пи­тательн. в-вами, необходимыми для приживания и роста эксплантов. Углеводы явл.необходимыми компонентами питательн. сред. Фитогормоны необх. для дедифференцировки клеток и для индукции клеточных делений. Органич. добавки и витамины исп. для индукции и роста каллуса из различных эксплантов. Различные добавки к питат. средам –жидкий эндос­перм кокосового ореха, каштана и другие, использ. для получения каллусной ткани. Приготовл. твердых питательных сред–добавл.веществ уплотнителей– агар-агра.Наиболее часто примен. в условиях in vitro яв­ляются среды Мурасиге-Скуга и Гамборга. 2. стерилизация питательных сред в питат. среде развиваются разл. микроорг. Стерилизуют в пробирках: емко­сти заполн. средой не более 1/2 их объема.Сосуды со средами закр. ватными пробками, обернутыми марлевой салфеткой.Режим автоклавиров. определ. их составом и термоустойч. ком­понентов. Оптимальный режим стерилиз. пита­тельных сред пригот. по прописи Мурасиге - Скуга и Гамборга считаются режимы автоклавирования при 121 (1 атм) от 15 до 45 мин. После автоклавирования питат. среду выдерж. 2-3 дня при температуре 25 С для провер. ее стерильности.Если заражена готовят заново. 3. стерилиз исходного материала во избежания поражения изолиров. эксплантов проводят поверхностную стерилизацию от наружной инфекции органов растений–моют в мыльном растворе и споласкивают дистиллиров. во­дой, погружают на несколько сек. в 70% этанол,тщательно промывают стерильной водой.Работы проводят в асептич.помещении (ламинар-боксе) стерильным инструмент. 4. условия культивирования Инициацию каллусогенеза у изолирован. клеток и тканей проводят в темноте. Затем переносят на свежую питательную среду с несколько измененным соста­вом, и помещают в условия периодического освещ., создаваемого люминисцентными лампами. Освещенность составляет в зависимости от культуры от 3000 до 10000 лк. Оптим.t для большинства культивируемых каллусных тканей достигает 25-26 С. Растительные клетки обладают свойством тотипотентности ­­ ­–из одной клетки могут быть регенерированы фертиль­ные растения. Любая растительная клетка со­держит весь набор генов,сохран. свойствен­ную зиготе программу развития(регенерируют в целое растение). Используя системы in vitro, можно реализовать тотипотентность одним из двух путей: 1) индукцией в каллусных тканях или культивируемых клетках цепи событий, связанных с образова­нием меристематических очагов, развитием на их основе зачатков стебле­вых апексов, появлением побегов, котор.после укоренения развиваются в целое растение; 2) индукцией развития клетки по пути зародышевой структуры, образующей проросток и растение.

 

31. клеточные технологии in vitro в селекции растений, их виды и задачи. Селекционная практика основывается на двух принцип. подходах: 1) создание генетического разнообразия. 2) отбор желаемых генотипов. Клеточные технологии предлагают новые пути для создания генетического разнообразия и отбора форм с искомыми признаками. Виды клеточных технологий в селек.рас-ний: 1.Для облегчения и ускорения селекционного процесса:а) Оплодотворение in vitro, б)Культура незрелых зиготических зародышей, в)Регенерация растений из тканей летальных гибридов, г)Экспериментальная гаплоидия, д)Клональное микроразмножение новых сортов, гибридов, линий (включая создание искусственных семян). 2. Для создания генетического разнообразия и скрининга генотипов с важными признаками: а)Использование сомаклональных вариантов, б)Получение индуцированных мутантов на клеточном уровне, в)Клеточная селекция, г)Гибридизация соматических клеток-создание неполовых гибридов путем слияния изолированных протопластов, полученных из соматических клеток. Этот метод позволяет скрещивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрестить обычным половым путем, вызывать слияние трех и более родительских клеток, получать асимметричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами или генами, или только органеллами и цитоплазмой другого., д)Перенос чужеродных цитоплазматических генов, ж)Перенос ядерных генов. Селекция растений. Одна из наиболее сильных сторон культуры in vitro в создании технологий для с/х - возможность на основе сомаклональных вариаций или индуцирован. мутаций отбирать в жестких селективных условиях клетки, характеризующиеся искомыми признаками. Для проведения клеточной селекции используют следующие приемы:1) прямая селекция,при кот.выживает лишь определ. искомый мутантный тип клеток;2) непрямая селекция, основ. на избирательной гибели делящихся клеток дикого типа и выживания метаболически неактивных клеток,3) тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются все клеточные клоны;4) визуальная селекция и неселективный отбор, когда вариантная линия может быть идентифицирована среди всей популяции клеток визуально или при использовании биохимических методов.Прямая селекция наибол. распростр.метод,для выделения растениий-регенерантов, устойчивых,к гербицидам,антибиотик.,токсинам,солям Для провед. работ по клет. селекции растений в кач-ве объекта исследов. использ. каллусные, суспензионные культуры или изолированные протопласты. Выбор объекта зависит от наличия разработанных технологий применительно к различным видам растений, а также от конечных целей исследовании.Проведение селекции на клеточном уровне позволяет создавать новые формы растений в 2-4 раза быстрее по сравнению с традиционными способами селекции.

32.Культивирование клеток и тканей животных.Технология трансплантации эмбрионов.

Применение методов генетической инженерии в животноводстве открывает перспективу изменения ряда свойств организма: повышение продуктивности, резистентности к заболеваниям, увеличение скорости роста, улучшение качества продукции. Животных, несущих в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген, принято наз.трансгенными, а ген, интегрированный в геном реципиента, — трансгеном. Продукт этого гена (белок) явл. трансгенным. Благодаря переносу генов у трансгенных животных возникают новые качества, а дальнейшая селекция позволяет закрепить их в потомстве и создавать трансгенные линии.

Получение трансгенных животных предусматривает ряд этапов: приготовление раствора ДНК для микроинъекции; извлечение эмбрионов из донорных организмов; микроинъекция ДНК и пересадка инъецированных эмбрионов в яйцеводы или после культивирования в матку синхронизированных реципиентов. У родившихся потомков исследуют экспрессию трансгена на уровне транскрипции и трансляции. Трансгенное потомство получают путем использования традиционных методов разведения животных. Следует отметить, что от приготовления инъекционного раствора ДНК (его чистоты, концентрации) во многом зависит эффективноcть получения трансгенных животных. Обычно гены транспортируют на ранних стадиях развития животного (в большинстве случаев на стадии зиготы и двухклеточных эмбрионов). Для трансформации генов в геном животного используют следующие приемы: микроб инъекцию ДНК в пронуклеус зигот или в каждый бластомер у двухклеточного эмбриона; введение ДНК с помощью ретровирусных векторов; получение трансгенных химер из генетически, трансформированных клеток и эмбрионов. В настоящее время наиболее распространенный метод — микроинъекция ДНК. После инъекции ДНК эмбрионы культивируют до момента пересадки реципиентам. После небольшого культивирования in vitro проинъецированные эмбрионы переносят в яйцеводы (хирургическим путем) реципиентов. Каждому реципиенту мыши, кролика и свиньи обычно пересаживают 20 — 30 инъецированных зигот, причем у свиней все эмбрионы трансплантируют в один яйцевод; у мышей и кроликов — раздельно по яйцеводам, а у овец, коз и крупного рогатого скота — по 2 —4 эмбриона каждому реципиенту. Используют методы блот-анализа, дот-блот-анализа и ПЦР, можно получить вполне надежные доказательства интеграции и экспрессии ДНК у трансгенных животных. С этой целью используют ядросодержащие клетки тканей или внутренних жидкостей реципиента, из которых выделяют ДНК.

 

33.Исследования, разработка приемов и методов клонирования животных. Проблема введения генов в клетки млекопитающих очень важна для исследования функционирования генов высших эукариот.Предварительно клонированные гены вводят в клетку животных различными путями. Суть одного из них состоит в трансформации клеток требуемым геном, соединенным с одним из генов, для которых осуществляется селекция. Для идентификации и последующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК, был разработан метод, получивший название метода маркера. Примером может служить метод получения клеток, дефектных по синтезу фермента тимидинкиназы (ТК-клетки). Такие клетки трансформировались фрагментами ДНК вируса герпеса (HSV), содержащего ген фермента ТК, и после трансформации они приобретали способность к синтезу фермента на селективной среде, т.е. становились ТК+-клетками. Клетки ТК+ легко отличаются от клеток ТК-, поскольку способны расти на средах с аминоптерином (ингибитор, блокирующий определенные стадии биосинтеза нуклеотидов), гипоксантином и тимидином. Следовательно, в данном случае для трансформации клеток животных были использованы гибриды бактериальных плазмид с геном ТК из вируса герпеса. Для этого предварительно проводили клонирование и идентификацию генов в клетках Е. coli и затем полученная рекомбинантная плазмида вводилась в ТК-клетки. Анализ методом бдот-гибридизации подтвердил, что выжившие клетки содержали интегрированный в геном ТК-ген вируса герпеса.

В последние годы сконструировано большое количество так называемых челночных векторов и их рекомбинантных производных, способных к репликации в животной и бактериальной клетках, экспрессирующие клонируемый ген в животной клетке. К числу таких векторов можно отнести векторы из плазмиды pBR322 и интактного района транскрипции ДНК SW-40. Одна из важнейших задач генной инженерии — разработка технологий по созданию векторов, подобных плазмидам, не убивающим клетку-хозяина и эффективно экспрессирующим клонируемый ген в животной клетке. Представляют немаловажный интерес микроинъекции ДНК непосредственно в ядро клетки. Так, плазмиды, содержащие фрагмент вируса герпеса с геном тимидинкиназы, и плазмиды pBR322 были инъецированы в ТК-клетки, при этом ТК-ген проник в ядра и нормально в них реплицировался. Трансформация соматических клеток млекопитающих открывает возможность для изучения механизмов регуляции экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат клетки животных, в том числе и человека. Культуры клеток млекопитающих могут быть эффективным источником выделения ряда вирусных антигенов с целью получения вакцин для животных и человека. В настоящее время разработаны способы введения генов в эмбриональные клетки млекопитающих, мух и некоторых растений с целью изменения свойств организма, таких, как скорость роста, устойчивость к заболеваниям и внешним воздействиям. Подобного рода работы были начаты с довольно крупными яйцами амфибий, а затем продолжены с яйцеклетками и эмбрионами мыши.

 

34. Клональное микроразмн. Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения - клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке) неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, т.е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму. Клональное микроразмножение имеет ряд преимуществ по сравнению с обычными методами вегетативного размножения: 1. Высокий коэффициент размножения. Так, из одного растения герберы, земляники, хризантемы, розы при размножении их посредством культуры тканей можно получить в год свыше 1 млн растений 2. Одновременно с микроразмножением происходит оздоровление растения от вирусов и патогенных микроорганизмов. 3. Ускорение селекционного процесса. Сроки получения товарной продукции новых сортов сокращаются до 2-3 лет вместо 10-12.4. Методом культуры тканей возможно размножение растений, которые с трудом или совсем не размножаются вегетативно, например пальмы. Так, методом клонального микроразмножения в промышленных масштабах размножается масличная пальма. 4. Экономичность. При микроразмножении экономятся площади теплиц. 5 Получение молодых растений (омоложение старых особей 6. Можно поддерживать рост круглый год, что важно для растений, имеющих в цикле развития периоды покоя. Клональное микроразмножение применяется для разведения декоративных (орхидеи, гвоздики, нарциссы, розы, фрезии, гиацинты, сирень), овощных (картофель, лук, чеснок, томаты овощных, нарциссы, розы.Среди злаковых этим методом размножают в промышленных масштабах только сахарный тростник и бамбук. Злаковые травы и зерновые культуры размножаются in vitro с трудом, и этот метод используется в селекционных работах в небольших масштабах.

 

 

35.Достижения биотехнологии. Получение антибиотиков в пром.условиях. Биотехнология явл-ся междисциплинарной областью знаний, базируется на микробиологии, биохимии, молекулярной биологии, биоорганической химии, биофизике, вирусологии, иммунологии, генетике, инженерных науках и электронике. Особенность биотехнологии в том, что использует технологии производства продуктов на ранних этапа развития микробиологического синтеза. Разработка биотехнологических процессов связана с большими капиталовложениями. В настоящее время достижения биотехнологии перспективны в следующих отраслях: в промышленности (пищевая, фармацевтическая, химичес­кая, нефтегазовая) — использование биосинтеза и биотрансфор­мации новых веществ на основе сконструированных методами ген­ной инженерии штаммов бактерий и дрожжей с заданными свой­ствами на основе микробиологического синтеза; в экологии — повышение эффективности экологизирован­ной защиты растений, разработка экологически безопасных тех­нологий очистки сточных вод, утилизация отходов агропромыш­ленного комплекса, конструирование экосистем; в энергетике — применение новых источников биоэнергии, полученных на основе микробиологического синтеза и моделиро­ванных фотосинтетических процессов, биоконверсии биомассы в биогаз; в сельском хозяйстве — разработка в области растениевод­ства трансгенных агрокультур, биологических средств защиты ра­стений, бактериальных удобрений, микробиологических методов рекультивации почв; в области животноводства — создание эф­фективных кормовых препаратов из растительной, микробной биомассы и отходов сельского хозяйства, репродукция животных на основе эмбриогенетических методов; в медицине — разработка медицинских биопрепаратов, моноклональных антител, диагностикумов, вакцин, развитие иммунобиотехнологии в направлении повышения чувствительности и специфичности иммуноанализа заболеваний инфекционной и неинфекционной природы.

Получение антибиотиков (А) в пром.условиях. Открытие А. произвело переворот в лечении инфекционных заболева­ний. Применяются в ряде отраслей народного хозяйства (расте­ниеводство, животноводство, ветеринария, пищевая промышлен­ность), медицине. К А. относятся низкомолекулярные эффекторы прир. происхождения. А., продуцируемые растит. объек­тами, называют фитонцидами. В зависимости от хим. природы и ряда др. св-в антибиотики делят на классы: Р-Лактамные (пенициллины, цефалоспорины); Тетрациклины (тетрациклин, морфоциклин, метациклин); Макролиды (эритромицин, олеандомицин); Аминогликозиды (гентамицин, амикацин); Гликопептиды (ванкомицин, ристомицин); Амфениколы (левомицетин); Линкосамиды (линкомицин); Полиеновые [противогрибковые (нистатин, леворин)]; Противоопухолевые (блеомицин) и др. Глав­ное направление получения новых А. состоит в хим. трансформации при­р. молекул для создания полусинтетических А., характеризующихся значительно меньшей резистентностью и ток­сичностью, но более широким спектром действия, большим вре­менем жизни, хим. и биол. устойчивостью. Существует несколько способов получе­ния А. На­правленный биосинтез А. - путем пря­мой ферментации микроорганизма, при сохранении в неиз­менном виде ядра пенициллина — 6-аминопенициллановой кис­лоты (6-АПК). В промышленности 6-АПК получают путем гидро­лиза природных пенициллинов с помощью специфического фермента — пенициллинацилазы, образующейся с высоким выхо­дом в процессе ферментации ряда штаммов микроорганизмов. Ацилазы различают по их субстратной специфичности. Бензилпенициллин гидролизуют ацилазой мутанта Kluyvera citrophi- la при рН 7,8 — 8,0 и Т= 40—50 "С. Затем в ферментер вно­сят мутант Pseudomonas melanogenum и фенилглицин. Условия фермен­тации изменяют (рН 5,0 — 5,5), чтобы ацилаза вто­рого мутантного организма осуществляла синтез ампициллина. Замена ацильного остатка приводит к синтезу других полусин­тетических А.; А. продуцируются плесневыми грибами, актиномицетами, эубактериями и др. микроорганизмами. Биосинтез А. возрастает в фазе замедленного роста клеточной популя­ции (конец трофофазы) и достигает максимума в стационарной фазе (идиофазе). Процесс культивирования идиолитов проходит две фазы (двустепенчатое культивирование). На первой фазе происходит накоп­ление достаточного количества биомассы, которая выращивается на среде для роста микроорганизма. Эта фаза должна быть быст­рой, а питательная среда дешевой. На второй фазе осуществляют­ся запуск и активный синтез А-ка. На этой фазе фермен­тацию ведут на продуктивной среде. Многие антибиотики берут свое начало от промежуточных соединений обмена первичных метаболитов, поэтому их биосинтез, регулируется путем ретроингибирования. Добавление в пит. среду а-аминоадипиновой к-ты предотвращает ингибирующий эффект лизина и активирует био­синтез пенициллина в отсутствие лизина. Сейчас внедряются полуне­прерывные и непрерывные процессы ферментации. Техно­логия завершающих стадий-процессов определяется природой антибиотика, характером производства и целями даль­нейшего использования А. Антибиотики выделяют в виде сравни­тельно неочищенных препаратов (натриевая соль пенициллина) или в виде высокоочищенных веществ (прокаиновая соль пени­циллина), предназначенных для клинического использования. Вы­ход антибиотиков обычно составляет несколько десятков граммов на 1 л.