Приборы, методы и среды для культивирования анаэробов

Микроанаэростат – используется для создания вакуума с дозированным содержанием кислорода. Прибор представляет собой герметически закрывающийся сосуд, снабжённый манометром, в который помещают посевы и откачивают воздух. Микроанаэростат помещают в термостат.

Эксикатор – стеклянный лабораторный сосуд с притёртой крышкой. В его донной части имеется дополнительная емкость, куда наливается смесь пирогаллола и едкого натра или гидросульфита натрия и двууглекислой соды. На сетку-подставку помещают посевы и притирают крышку с помощью вазелина. Эксикатор помещают в термостат.

Метод Фортнера. В чашку Петри наливают питательный агар с
1-2% глюкозы. Посредине чашки стерильным скальпелем вырезают канавку шириной приблизительно 1 см. Одну половину чашки засевают культурой аэробов (сарцина, кишечная палочка), вторую – культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом. Засеянную чашку закрывают, герметизируют и помещают вверх дном в термостат. Быстрорастущие аэробы, поглощая кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробных микроорганизмов.

Метод Перетца. В стерильную чашку Петри помещают стеклянные палочки, на которые кладут стеклянные пластинки или предметные стекла. В пробирку с 20 мл расплавленного и охлажденного до 50⁰С МПА с 10% глюкозы (pH 7,0-7,2) вносят исследуемый материал и добавляют 2-4 капли 10% гидросульфита натрия на 10% растворе углекислой соды. Содержимое пробирки быстро перемешивают и выливают в чашку с таким расчётом, чтобы агар заполнил пространство между стеклянной пластинкой и дном чашки. Чашки инкубируют при 37⁰С 24-48 часов. Колонии анаэробов вырастают под стеклянной пластинкой.

Метод Вейон-Виньяля. В пробирку с 0,5% расплавленным и охлажденным до 40-45⁰С сахарным агаром вносят исследуемый материал и перемешивают. При необходимости материал разводят путём переноса в последующие 2-3 пробирки с расплавленным агаром. Содержимое пробирок набирают в пастеровские пипетки. После заполнения пипетки вытянутый конец запаивают, а противоположный конец закрывают стерильной ваткой и заливают парафином. Трубки помещают в термостат; через 2-3 суток в агаре вырастают глубинные колонии, видимые в проходящем свете, которые можно изолировать. Для этого трубку надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию извлекают петлёй и пересевают для накопления чистой культуры в соответствующую питательную среду.

Метод Биттнера. К крышке чашки Петри с посевом исследуемого материала или выделенной культуры анаэробов прикрепляют пакет из фильтровальной бумаги, содержащей пирогаллол, К₂СО₃ и тальк. Чашку герметизируют при помощи парафина или скотча. Содержимое пакета увлажняется за счёт образующегося конденсата, и ингредиенты вступают в реакцию, которая сопровождается поглощением О₂ и выделением СО₂.

Газ-пак (Generbag anaer). Система Generbag anaer состоит из воздухонепроницаемых пакетов, изготовленных из прозрачной пластмассы и генераторов, содержащих смесь веществ, поглощающих кислород. Последовательность работы: вынуть генератор из пакета, поместить в нижнюю часть воздухонепроницаемого пакета, затем поместить чашки (или пробирки) с посевами и с помощью специальной скрепки закрыть пакет. Инкубация при 37⁰С.

Среда Китта-Тароцци. Содержит мясо-пептонный бульон, 0,5% глюкозы и 0,15% агара. На дно пробирки для адсорбции О₂ помещают кусочки варёной печени или фарша слоем 1-1,5 см и заливают 6-7 мл среды. Среду перед посевом регенерируют (прогревают 15-20 мин. на водяной бане для удаления воздуха, а затем быстро охлаждают). После посева среду заливают вазелиновым маслом и помещают в термостат.

Полужидкий сахарный агар (высокий столбик). В пробирку с
6-7 мл расплавленного и охлаждённого до 40-45⁰С полужидкого питательного агара, содержащего 0,5-1% глюкозы, вносят исследуемый материал и перемешивают. Посевы помещают в термостат.

Среда для контроля стерильности (СКС). Рост многих анаэробных микроорганизмов возможен только на средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом. Поэтому в среды добавляют восстановители, например, тиогликолевую кислоту или её натриевую соль, цистеин, аскорбиновую кислоту. Функции восстановителей выполняют и другие компоненты среды: глюкоза, пептон. СКС содержит питательный бульон, витаминный препарат ЭКД, NaCl, Na₂CO_3, глюкозу, тиогликолят натрия, цистеин, агар (0,75%). Среду разливают в пробирки по 6-7 мл.

Контрольные вопросы

Химический состав бактериальной клетки: содержание, локализация в клеточных структурах и биологическая роль воды, белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов и минеральных веществ. Источники азота, углерода. Факторы роста. Что такое энергетический и конструктивный метаболизм? Особенности обмена веществ бактерий. Ферменты бактерий. Механизм расщепления веществ. Способы поступления их в клетку. Типы питания микробов. Могут ли микроорганизмы изменить тип питания? Каковы типы питания патогенных микробов? Каким требованиям должны соответствовать питательные среды? Классификация питательных сред по консистенции, по целевому назначению. Основные питательные среды. Специальные питательные среды, их названия; для каких бактерий предназначены? Элективные питательные среды, состав, применение. Приведите примеры. Дифференциально-диагностические среды, их названия; для чего применяются? Что такое рост микробов, размножение микробов? Как размножаются бактерии? Фазы роста бактериальной культуры в жидкой питательной среде (начертить кривую). Размножение бактерий в непрерывно–проточной среде. Условия культивирования бактерий. Что такое культура бактерий, чистая культура, штамм? Особенности биологического окисления у микробов. Группы микробов по типу биологического окисления. Каковы различия между аэробным и анаэробным типом (основные этапы, ферменты, участие свободного кислорода, конечный акцептор водорода, продукты окисления). Перечислите патогенные анаэробы. Что такое окислительно-восстановительный потенциал среды, какие микробы лучше растут при низких его значениях, какие - при более высоких? Типы брожения. Что такое аэрация питательной среды, как она осуществляется? Особенности культивирования анаэробных бактерий. Среды, методы и приборы, используемые для их культивирования. Среда Китта-Тароцци: на чём основано её действие, что входит в её состав, что делают со средой перед посевом и для чего? Рассказать поэтапно выделение чистой культуры микробов-аэробов. Рассказать поэтапно выделение чистой культуры микробов–анаэробов. Что такое психрофилы, мезофилы, термофилы? Оптимальная температура для роста патогенных микробов.

 

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

В тетради перепишите схемы выделения чистых культур аэробов и анаэробов и впишите цель посева на каждом этапе.

Заполните таблицу «Культивирование анаэробов».

№	Способ культивирования	Сущность способа	Используемые
приборы	методы	среды
1.	Физический
2.	Химический
3.	Биологический
4.	Комбинированный

Самостоятельная работа студента на практическом занятии

1. Ознакомление с питательными средами. Изучите питательные среды и распределите их по назначению: основные, специальные, элективные, дифференциально-диагностические.

2. Методы посева бактериальных культур с соблюдением правил асептики. Ознакомьтесь с особенностями техники пересева бактериальных культур на плотные и на жидкие питательные среды.

3. Выделение чистой культуры бактерий–аэробов. Ознакомьтесь с методом получения изолированных колоний путем посева на чашке с питательной средой (демонстрация преподавателем). Из смеси бактерий приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте. Произведите посев смеси бактерий на чашку с питательной средой, укажите цель посева.

4. Методы культивирования и выделения чистых культур анаэробов. Ознакомьтесь с аппаратурой для культивирования анаэробов. Из посева на среде Китта–Тароцци приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте. Внимательно проследите за демонстрацией преподавателем посева по методу Вейнберга в трубки Вейон-Виньяля.

 

ЗАНЯТИЕ 7

ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ (ПРОДОЛЖЕНИЕ)
МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ

Знание методов стерилизации необходимо врачу любой специальности. Поэтому следует тщательно изучить этот материал и знать конкретно методики, аппаратуру, режим стерилизации.

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения темы студент должен знать:

- культуральные свойства микробов;

- понятие о стерилизации, дезинфекции, асептике и антисептике, методы стерилизации;

- устройство термостатов.

 

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала необходимо знать:

- схему выделения чистой культуры аэробов и анаэробов;

- условия, необходимые для культивирования микробов;

- характеристику роста микробов на плотных и на жидких питательных средах; морфологию колоний микробов, пигменты микробов.

 

Цель занятия

1. Изучить культуральные свойства бактерий.

2. Ознакомиться с особенностями бактериологического метода выделения чистых культур анаэробных микроорганизмов.

3. Ознакомиться с основными методами стерилизации, применяемыми в микробиологии и медицине.

 

План изучения темы

1. Повторите схему выделения чистой культуры бактерий – аэробов и анаэробов.

2. Понятие о культуральных свойствах микробов;

а) условия, необходимые для культивирования данного вида (питательная среда, рН, гН₂, температура, аэробные или анаэробные условия);

б) характер роста данного вида микробов на питательных средах.

3. Пигменты микробов, их характеристика.

4. Методы стерилизации.

 

После изучения темы студент должен уметь

1. Охарактеризовать колонии микроорганизмов.

2. Провести посев изолированных колоний на скошенный питательный агар.

3. Выбрать средства, режим стерилизации в соответствии с конкретными задачами.