Количественные методы или методы титрования бактериофагов

Титрование бактериофагов проводится с использованием культур чувствительных бактерий в жидких и плотных питательных средах.

 

Метод титрования бактериофага по Аппельману
(на жидкой питательной среде)

Готовят десятикратные разведения исследуемого бактериофага в питательном бульоне. Для этого в ряд пробирок разливают по 4,5 мл бульона. В 1-ю пробирку добавляют 0,5 мл исследуемого фага. Тщательно перемешивают и переносят в последующие пробирки (из пробирки в пробирку) по 0,5 мл соответствующего разведения фага с уменьшением его концентрации в десять раз. Получают разведения от 10^-1 до 10^-9 степени. Затем в пробирки вносят по 1 капле суточной культуры соответствующих бактерий. После инкубации в течение суток определяют титр фага. За титр бактериофага принимают то его максимальное разведение, при котором наблюдается полный лизис культуры (просветление среды).

Метод титрования бактериофага по Грациа
(на плотной питательной среде)

Питательный агар разливают в чашки Петри и подсушивают в термостате. Готовят полужидкий питательный агар по 3–4 мл в пробирке и растапливают его на водяной бане. Делают десятикратные разведения исследуемого бактериофага в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем 0,5 мл каждого разведения бактериофага смешивают с таким же объёмом суточной бульонной культуры чувствительных к бактериофагу бактерий и выливают эту смесь в пробирку с полужидким агаром температурой 45°C. Приготовленную смесь быстро выливают на поверхность первого слоя агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 37°C в течение суток. Смеси бактериофага, культуры и полужидкого агара делают из разведений фага 10²–10¹⁰, в зависимости от предполагаемого титра фага.

Не заражённые бактериофагом бактерии, размножаясь, образуют сплошной газон роста на поверхности питательного агара. Каждая инфицированная бактериофагом бактерия лизируется и освобождает потомство бактериофага, которое внедряется в интактные клетки бактерий, и весь цикл повторяется. В результате лизиса клеток на сплошном бактериальном газоне появляются «стерильные» пятна или негативные колонии бактериофага. Число этих пятен соответствует количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Количество пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии бактериофага называется его титром.

Фаготипирование бактерий

Метод фаготипирования имеет большое значение при эпидемиологических исследованиях, так как позволяет выявить источник и пути распространения возбудителей заболеваний. Определение фаговара выделенной чистой культуры проводят с помощью набора типовых диагностических бактериофагов. Фаговар культуры определяют по тому типовому фагу, который вызвал её лизис.

Для проведения фаготипирования исследуемую суточную культуру бактерий засевают «газоном» на поверхность питательного агара в чашки Петри, подсушивают в термостате, делят со стороны дна чашки на квадраты и наносят пипеткой по одной капле соответствующего бактериофага в тест-разведении, указанном на ампуле. В один квадрат бактериофаг не вносят, для контроля роста культуры. Чашку термостатируют при 37^оС 18-20 часов, после чего оценивают результат реакции. Положительный результат реакции фаголизиса – лизис культуры в месте нанесения бактериофага («негативные» колонии) при наличии роста в контроле свидетельствует о соответствии культуры бактериофагу и принадлежности с учетом её фаголизабельности к соответствующему виду.

Применение бактериофагов

Применяемые на практике препараты бактериофагов представляют собой фильтрат бульонной культуры соответствующих микробов, лизированных фагом, содержащий живые частицы фага, а также антигены бактерий, освободившиеся из бактериальных клеток при их лизисе. Полученный препарат – жидкий бактериофаг – должен иметь вид совершенно прозрачной жидкости желтого цвета большей или меньшей интенсивности. Препарат проходит контроль на стерильность (методом посева), безвредность и литическую активность (титр).

Диагностические бактериофаги выпускаются как в жидкой, так и в сухой форме, в ампулах. Перед началом работы сухой бактериофаг разводится.

Для лечебно-профилактических целей бактериофаги выпускаются в форме таблеток с кислотоустойчивой оболочкой, в жидком виде или в суппозиториях. Таблетированный сухой бактериофаг более стабилен при хранении и удобен при применении. Одна таблетка сухого бактериофага соответствует 20-25 мл жидкого препарата. Срок годности сухого и жидкого препарата составляет 1 год. Жидкий бактериофаг следует хранить при температуре +2 – +10⁰С, сухой – не выше +1⁰С, но его можно хранить в холодильнике и при отрицательной температуре.

Принятый внутрь бактериофаг сохраняется в организме в течение 5-7 дней. Как правило, приём бактериофага не сопровождается какими-либо реакциями или осложнениями. Противопоказаний к приему нет.

Бактериофаги могут применять также в виде орошений, полосканий, примочек, тампонов. Инъекционные формы бактериофагов можно вводить в стерильные полости – брюшную, плевральную, суставную и в мочевой пузырь. Существует форма выпуска бактериофагов в свечах для ректального применения.

Контрольные вопросы

Дайте определение понятия «химиотерапевтический препарат». Назовите фамилию учёного, разработавшего теорию химиотерапии. Какие свойства являются определяющими при выборе химиотерапевтического препарата? Что такое бактерицидное и бактериостатическое действие препарата? Что такое химиотерапевтический индекс, напишите его формулу, для чего применяется этот показатель? Укажите первые антиспирохетные препараты, синтезированные Эрлихом. Назовите группы химиотерапевтических препаратов, приведите примеры. Назовите фамилию учёного, впервые получившего антибактериальный препарат, и название препарата. Дайте определение понятию «антибиотик». Назовите фамилии русских учёных, впервые обнаруживших антибактериальные свойства зелёной плесени. Назовите фамилию учёного, изучавшего свойства зелёной плесени и сделавшего попытку выделить пенициллин. Назовите фамилии учёных – зарубежных и отечественных, получивших первый антибиотик из зелёной плесени. Назовите фамилию учёного, впервые получившего стрептомицин. Классификация антибиотиков по происхождению (источнику получения), по химическому составу. Механизм действия антибиотиков: «мишени» (точки приложения различных групп антибиотиков). Что означает понятие «спектр действия» антибиотиков? Назовите антибиотики активные преимущественно по отношению к грамотрицательным бактериям, преимущественно по отношению к грамположительным бактериям, антибиотики широкого спектра действия, противовирусные, противогрибковые, противоопухолевые антибиотики. Методы определения активности антибиотиков; в каких единицах измеряется антибактериальная активность антибиотиков? Основные проявления побочного действия антибиотиков. Виды лекарственной устойчивости микробов по происхождению. Генетические механизмы лекарственной устойчивости. Фенотипические (биохимические, структурные) механизмы лекарственной устойчивости. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам, техника исследования и оценка результатов. Какие существуют способы предупреждения и преодоления лекарственной устойчивости микробов? Назовите препараты, предназначенные для преодоления лекарственной устойчивости и применяемые в сочетании с антибиотиками.

ЗАДАЧА 1. Укажите культуру, наиболее чувствительную к пенициллину, если диаметр зоны задержки роста вокруг диска равняется: кишечная палочка – 0 мм; стафилококк – 15 мм; стрептококк – 30 мм; палочка дифтерии – 13 мм.

ЗАДАЧА 2. Выберите наиболее эффективный антибиотик для лечения больного, если при определении лекарственной устойчивости возбудителя методом стандартных дисков установлены диаметры зон задержки роста: пенициллин – 0 мм; стрептомицин – 13 мм; тетрациклин – 28 мм; эритромицин –15 мм.

ЗАДАЧА 3. Применение пенициллина для лечения стафилококкового заболевания у больного оказалось неэффективным. Какую можно предположить причину неэффективности пенициллина? Как можно проверить это предположение? Какие методы можно применить для этого?

ЗАДАЧА 4. У больного Н. с диагнозом бактериальная дизентерия до начала лечения выделен возбудитель дизентерии, чувствительный ко всем антибиотикам. Больной лечился левомицетином, с другими больными дизентерией не контактировал. На третий день после начала лечения снова выделен возбудитель дизентерии, который оказался устойчивым одновременно к трём антибиотикам: левомицетину, тетрациклину и стрептомицину. Как могла возникнуть множественная лекарственная устойчивость у возбудителя дизентерии в данной ситуации? Как доказать предполагаемый вами механизм возникновения множественной лекарственной устойчивости.

Свойства бактериофагов. Природа – к какому царству живых существ относится? Строение - какую форму чаще всего имеет? Какие химические компоненты содержит? Структурные элементы бактериофага. Размеры – в каких единицах измеряется величина бактериофагов? Назовите фамилии учёных, открывших явление бактериофагии. Опишите фазы взаимодействия вирулентного (инфекционного) бактериофага с чувствительной к нему бактериальной клеткой. Как обнаружить действие бактериофага на бактерии в жидкой и плотной питательной среде? Как будет выглядеть положительный результат? Что такое титр бактериофага? Как определяют и обозначают титр бактериофага? Что такое умеренный бактериофаг, профаг, лизогенная культура, лизогенная конверсия, трансдукция? Опишите взаимодействие умеренного бактериофага с бактериальной клеткой. Применение бактериофагов в практической медицине – на каком свойстве оно основано? Назовите бактериофаги, применяющиеся для лечения, для диагностики, для фаготипирования.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки.

Заполните в тетради таблицы «Принципы классификации антибиотиков», «Механизмы развития приобретённой лекарственной устойчивости к антибиотикам». Перечислите принципы рациональной антибиотикотерапии и осложнения и побочные эффекты антибиотикотерапии.