Ускоренные методы диагностики анаэробной газовой инфекции

1. Исследуемый материал засевают в 10 пробирок с полужидкой средой и затем 5 пробирок прогревают при 80⁰С 20 минут для уничтожения вегетативных форм бактерий. После этого в пробирки добавляют различные моновалентные противогангренозные сыворотки. Обнаружение через 10-18 часов микробов в стрептобациллярной форме и роста их изолированными колониями подтверждает соответствие возбудителя типу сыворотки. Диффузный рост и беспорядочное расположение клостридий указывает на несоответствие возбудителя типу сыворотки.

2. Внутрикожная проба на морских свинках. Материал от больного (тканевая жидкость) вводят внутрикожно в область предварительно выбритой брюшной стенки морским свинкам в смеси с моновалентными противогангренозными сыворотками и одному животному без сыворотки (контроль). Наблюдение за животными ведут в течение 24 часов. При нейтрализации токсина, содержащегося в содержимом раны, специфической сывороткой реакция отсутствует. Если сыворотка оказалась неспецифической (как и в контроле), на месте введения материала кожа морских свинок окрашивается в синий или фиолетовый цвет.

Микробиологические методы идентификации микробов
рода Staphylococcus

Целью идентификации является установление рода и вида выделенной чистой культуры. Род стафилококка относится к семейству Micrococcaceae, в которое входят также роды Micrococcus и Planococcus. Общими чертами представителей этого семейства являются: морфология, положительная окраска по Граму; наличие фермента – каталазы.

Род Staphylococcus состоит из нескольких видов, наиболее важными из которых являются S.аureus, S.epidermidis и S.saprophyticus. Представители последних двух видов являются коагулазоотрицательными и долгое время считались непатогенными. В настоящее время доказано, что эпидермальный стафилококк может вызвать такие заболевания, как эндокардит, сепсис, конъюнктивит, инфекция ран и мочевыводящих путей, послеродовые инфекции, а сапрофитический – острый уретрит, цистит и др. На первом этапе устанавливается принадлежность выделенной культуры к семейству Micrococcaceae и роду Staphylococcus. На принадлежность культуры к семейству микрококков указывает положительная проба на каталазу, так как другие кокки (в частности стрептококки), каталазу не образуют. Для установления принадлежности культуры к роду Staphylococcus основными методами являются культуральный и биохимический.

Культуральный метод. Основным отличием стафилококков от микрококков является окраска колоний на плотной среде. Для стафилококков характерна золотистая или белая окраска колоний. У микрококков колонии окрашены в желтый или розовый цвет.

Биохимический метод. Он основан на том, что стафилококки являются факультативными анаэробами, микрококки – облигатными аэробами. В связи с этим стафилококки способны расти и ферментировать глюкозу в анаэробных условиях, а микрококки лишены этой возможности. Для определения этого признака культуру засевают петлёй в столбик полужидкой среды, содержащей 1% глюкозы и индикатор на кислые продукты. Сверху среду заливают стерильным вазелиновым маслом и ставят в термостат при 37⁰С на 5 суток. Рост культуры и изменение цвета среды указывает на принадлежность её к роду Staphylococcus.

Видовая идентификация стафилококков. S.aureus отличается от других видов наличием золотистого или палевого пигмента (в большинстве случаев), наличием ферментов: плазмокоагулазы, лецитиназы (лецитовителлазы) и ДНК-азы. Плазмокоагулазу определяют путём посева культуры в цитратную кроличью плазму, после чего посевы помещают в термостат при 37⁰С и регистрируют результаты через 1, 2, 4, 6 и 18 часов. Появление на дне пробирки студнеобразного сгустка любого размера считается положительным результатом реакции. Лецитиназу определяют путём посева культуры на молочно-желточный солевой агар. В составе яичного желтка имеется лецитовителлин, а наличие молока стимулирует образование пигмента. Посевы выдерживают в термостате при 37⁰С 18-24 часа. О наличии лецитиназы свидетельствует образование вокруг колоний радужного венчика.

Определение ДНК-азы. Принцип метода: под действием ДНК-азы добавленная в плотную среду высокополимерная ДНК распадается на низкополимерные фрагменты. При этом мутная среда, содержащая высокополимерную ДНК, становится прозрачной. Ход исследования: на питательную среду в чашке Петри, включающую от 50 до 200 мг ДНК и 0,5 мл 10% раствора хлористого кальция, штрихами засевают исследуемую культуру и помещают в термостат при 37⁰С на 18-24 часа. После этого на поверхность агара заливают 5-7 мл 3 моль/л раствора соляной кислоты. Если через 2-3 минуты вокруг посевов появляются зоны просветления, то реакция считается положительной

Если культура имеет золотистый (палевый), пигмент, коагулирует плазму и обладает хотя бы одним из двух других ферментов (лецитиназа, ДНК–аза) – её относят к виду золотистого стафилококка. При отсутствии полного набора указанных признаков (основным является наличие плазмокоагулазы) проводят идентификацию видов эпидермального и сапрофитического стафилококков по трем основным признакам, отличающим эти два вида (см. таблицу).

 

Вид стафилококка	Устойчивость к новобиоцину	Фосфатаза	Ферментация маннита
эпидермальный	-	+	-
сапрофитический	+	-	+

 

Устойчивость к новобиоцину определяют путём посева культуры на среду, содержащую 2 мкг/мл новобиоцина. Ферментацию маннита проводят в аэробных условиях путём посева культуры бляшкой на поверхность среды в чашке Петри, содержащей 1% маннита и индикатор на кислые продукты. Появление окрашенных колоний (в цвет индикатора) указывает на способность культуры ферментировать маннит. Таким образом, для эпидермального стафилококка характерны:

- чувствительность к новобиоцину;

- наличие фосфатазы и неспособность окислять маннит.

Для сапрофитического стафилококка характерны противоположные свойства.

Выделенные культуры S.aureus обычно подвергают фаготипированию с международным набором фагов (22 фага). Определение фаготипа стафилококка помогает установить источник инфекции и принадлежность выделенной культуры к госпитальным штаммам.

 

Контрольные вопросы

Опишите по дням ход исследования и результаты при выделении золотистого стафилококка из гноя. Опишите по дням ход исследования и результаты при подозрении на сепсис: сколько крови взять, в какую питательную среду посеять, какое количество питательной среды взять, в каких условиях производится взятие крови и её посев. Дальнейший ход исследования описать отдельно при обнаружении стафилококка и стрептококка. Какие материалы исследуют при подозрении на стафилококковое пищевое отравление, что обнаруживают в исследуемых материалах, на каких животных ставится проба? Идентификация чистой культуры стафилококка: по каким признакам определяют родовую и видовую принадлежность. Методы определения факторов патогенности стафилококка: пламокоагулазы, лецитовителлазы, ДНК-азы. Фаготипирование стафилококков: с какой целью проводится, каким набором фагов, методика фаготипирования. Схема микробиологического исследования при пищевой интоксикации стафилококкового происхождения. Опишите по дням ход исследования и результаты при выделении стрептококка из гноя. Краткая характеристика основных видов из группы грамотрицательных микроорганизмов. Синегнойная палочка: название по–латыни, морфология, культивирование, пигментообразование, основные факторы вирулентности; группы больных, у которых чаще всего наблюдается синегнойная инфекция. Протей: название по-латыни, морфология и физиология, особенности культуральных свойств. Кишечные палочки: наиболее частые формы инфекции (места локализации воспалительных процессов). Характеристика возбудителей анаэробной газовой инфекции (основных трёх видов): название видов по-латыни, морфология (споры, жгутики, капсула). Окраска по Граму, способ биологического окисления, среды для культивирования, характер колоний в толще агара, изменения на среде Вильсон-Блера, изменения на молоке; свойства токсина, действие в организме, серологические типы токсина. Факторы инвазивности. Характеристика неспорообразующих (неклостридиальных) анаэробов. Классификация: семейства, роды, основные виды (названия по-латыни). Основные свойства: морфология, отношение к окраске по Граму, условия культивирования. Ассоциация микроорганизмов (смешанная инфекция) при гнойных и раневых инфекциях: наиболее частые сочетания, особенности микробиологической диагностики при ассоциациях возбудителей.

 

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Написать по-латыни названия видов неспорообразующих анаэробов, грамотрицательных микроорганизмов – возбудителей раневых и гнойных инфекций и названия возбудителей анаэробной газовой инфекции.

 

Самостоятельная работа студента на практическом занятии

1. Продолжение исследования гноя (2-й день). Изучите и опишите колонии стафилококка на чашках с кровяным агаром. С помощью миллиметровой бумажки определите диаметр зон задержки роста вокруг дисков с антибиотиками и сделайте вывод о чувствительности микрофлоры гноя к антибиотикам. Проведите идентификацию выделенной чистой культуры стафилококка:

а) учтите результаты посева на анаэробное сбраживании глюкозы;

б) поставьте реакцию плазмокоагуляции: в пробирку с 0,5 мл кроличьей цитратной плазмы в разведении 1:4 (опыт) и в другую пробирку с 0,5 мл раствора хлорида натрия (контроль) внесите по 1 петле исследуемой культуры стафилококка. Пробирки поставьте в термостат. В конце занятия проверьте результат и сделайте вывод, данные запишите в журнал;

в) учтите результаты посева на лецитовителлазу;

г) учтите результаты посева на ДНК-азу;

д) учтите результаты фаготипирования.

Все результаты запишите в журнал, обобщите полученные данные, сформулируйте заключение, внесите его в графу «Результат».

2. Продолжение исследования крови на сепсис (3-й день). Изучите колонии на кровяном агаре, обратите внимание на размеры колоний, зоны гемолиза, определите вид стрептококка (по гемолизу). Приготовьте мазок из колоний, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте. Результаты запишите в журнал, сделайте заключение по исследованию крови на данном этапе, а в графе «Примечания» отметьте какие ещё исследования следовало бы провести для определения вида стрептококка и его антигенной структуры.

3. Продолжение исследования на стафилококковое носительство. Изучите и опишите характер колоний на молочно-солевом агаре. Сделайте мазок и, после окраски по Граму, промикроскопируйте. Результаты запишите в журнал, сделайте вывод. В графе «Примечания» опишите, какие исследования надо провести, чтобы дать заключение о наличии или отсутствии стафилококкового носительства.

4. Разберите схему исследования при стафилококковой интоксикации.

5. Изучите профилактические и лечебные препараты, применяемые при стафилококковых и стрептококковых инфекциях. Посмотрите препараты, прочитайте этикетки, охарактеризуйте каждый препарат по схеме: что собой представляет (вакцина, анатоксин, сыворотка, иммуноглобулин и др.), что содержит (антиген, антитело), как приготовлен, для чего применяется. Если препарат лечебно-профилактический – какое оказывает действие на организм. Дозируется ли препарат и в каких единицах? Если диагностический – что выявляют с помощью этого препарата?

6. Исследование отделяемого раны на возбудителей анаэробной газовой инфекции. Ознакомьтесь с сопроводительной запиской и внесите данные в журнал. Приготовьте мазок из отделяемого раны, окрасьте по Граму, промикроскопируйте. Произведите посев на среду Китта–Тароцци, на среду Вильсон–Блера и на молоко. Проделанную работу и результаты запишите в журнал.

ЗАНЯТИЕ 26

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА АНАЭРОБНЫХ
ИНФЕКЦИЙ, ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ
ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫМИ ПАЛОЧКОВИДНЫМИ
МИКРООРГАНИЗМАМИ (ПРОДОЛЖЕНИЕ), ДИФТЕРИИ

Хотя вызываемые анаэробами заболевания (столбняк, анаэробная газовая инфекция, ботулизм) встречаются сравнительно редко, лечение их представляет большие трудности, особенно при запоздалой диагностике. Поэтому важное значение приобретают профилактика и ранняя диагностика столбняка, анаэробной газовой инфекции и ботулизма.

В результате плановой специфической профилактики дифтерия в последние годы встречается в виде спорадических случаев. Однако наличие бактерионосительства и определённой прослойки неиммунизированных людей создает условия для возникновения отдельных случаев и даже вспышек дифтерии.

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения темы вы должны знать свойства возбудителей столбняка, ботулизма и дифтерии. Составьте схемы лабораторной диагностики этих заболеваний и усвойте методы их специфической профилактики и лечения. Обратите внимание на особенности исследований для обнаружения неспорообразующих анаэробов, а также особенности лабораторных исследований при смешанных инфекциях.

Исходный уровень знаний

Восстановите в памяти методы культивирования и выделения чистых культур анаэробов, свойства экзотоксинов, особенности антитоксического иммунитета, получение и способы введения антитоксических гетерологичных сывороток для предупреждения аллергических реакций.

 

Цель занятия

1. Изучить принципы лабораторной диагностики инфекций, вызванных клостридиальными и неспорообразующими анаэробами.

2. Изучить принципы лабораторной диагностики инфекций, вызванных грамотрицательными палочковидными микроорганизмами.

3. Ознакомиться с возбудителем ботулизма, его морфологией, культуральными свойствами и факторами патогенности.

4. Изучить принципы лабораторной диагностики ботулизма.

5. Ознакомиться с возбудителями дифтерии, их морфологией, культуральными свойствами и факторами патогенности.

6. Изучить принципы лабораторной диагностики дифтерии.

7. Ознакомиться с набором иммунобиологических препаратов для диагностики, лечения и профилактики анаэробных инфекций и дифтерии.

 

План изучения темы

1. Методы культивирования и выделения чистых культур анаэробов.

2. Характеристика возбудителей и лабораторная диагностика столбняка, анаэробной газовой инфекции.

3. Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых неспорообразующими анаэробами.

4. Характеристика аэробных грамотрицательных палочек и лабораторная диагностика гнойных и раневых инфекций, вызываемых этими бактериями.

5. Специфическая профилактика и лечение столбняка, анаэробной газовой инфекции.

6. Характеристика возбудителя ботулизма.

7. Характеристика возбудителей дифтерии.

Повторите по учебнику разделы: «Споры и спорообразование»; «Микробные токсины»; по руководству - методы культивирования и выделения чистых культур анаэробов. Обратите внимание на схемы микробиологических исследований при анаэробной газовой инфекции, столбняке, ботулизме.

После изучения темы студент должен уметь

1. Идентифицировать по культуральным свойствам P.aeruginosa и протей.

2. Проводить исследования при выделении возбудителя анаэробной газовой инфекции.

3. Классифицировать биологические препараты по теме занятия в соответствии с их назначением.

 

Контрольные вопросы

Перечислить методы культивирования анаэробов. Как создаются анаэробные условия при применении этих методов? Методы выделения чистой культуры анаэробов (назвать и описать). Какой материал нужно взять от больного с предполагаемым диагнозом «анаэробная газовая инфекция»? Опишите результаты, которые наблюдаются при посеве на соответствующие среды материала, содержащего Clostridium perfringens; через какой срок после посева нужно учитывать результаты? Какие препараты применяются для активной иммунизации против анаэробной газовой инфекции? В каких случаях проводится пассивная иммунизация против анаэробной газовой инфекции, какими препаратами, как они вводятся? Правила забора и пересылки в лабораторию материала от больного при подозрении на анаэробную инфекцию, вызванную неспорообразующими анаэробами. Культивирование неспорообразующих анаэробов: питательные среды, газовые смеси, длительность культивирования. Методы дифференцировки неспорообразующих анаэробов. Методы выделения и идентификации синегнойных палочек, протеев из гноя при раневой и гнойной инфекции. Характеристика возбудителя столбняка: название по-латыни, морфология (споры, жгутики, капсулы), отношение к окраске по Граму, способ биологического окисления, устойчивость спор, характер токсина: действие на организм, имеются ли серологические типы токсина. Столбняк у человека: механизм заражения, основной фактор патогенности. Методика обнаружения токсина в биологической пробе. Препараты для специфической профилактики и лечения. Плановая профилактика столбняка и профилактика столбняка по показаниям.

ЗАДАЧА. В больницу поступили два пациента, получившие травму (повреждение кожных покровов). При опросе выяснилось, что один из них, тракторист М., 22 лет, во время службы в армии получил плановые профилактические прививки, в том числе и против столбняка. Вторая пациентка, колхозница 50 лет, в последние 30 лет не прививалась против столбняка. Врач с целью профилактики столбняка назначил первому пациенту введение столбнячного анатоксина, второй – введение анатоксина и противостолбнячной сыворотки. Правильно ли сделал назначения врач? Почему в первом случае врач счёл возможным ограничиться введением анатоксина, а во втором назначил еще и сыворотку?

Характеристика возбудителя ботулизма: название, морфология, споры, жгутики, капсула, окраска по Граму, условия культивирования, гибнет ли при кипячении, характер токсина, серологические типы, отношение токсина к соляной кислоте и пищеварительным ферментам, к температуре 80⁰С и к высоким концентрациям хлористого натрия. Ботулизм у человека: вследствие чего возникает заболевание, при каких условиях это может произойти; основной фактор патогенности возбудителя, действие его в организме; какие материалы берут для лабораторного исследования, что обнаруживают в исследуемом материале? Опишите методы обнаружения ботулинического токсина в крови больного, в пищевом продукте, определение типа токсина. Препараты для активной иммунизации и лечения ботулизма; что они содержат, в каких единицах дозируются?

Характеристика возбудителя дифтерии: название по-латыни, морфология (форма, взаимное расположение клеток, споры, жгутики, капсула, включения), отношение к окраске по Граму, специальные методы окраски; способ биологического окисления, среды для культивирования, характер роста на свёрнутой сыворотке и теллуритовой среде, биологические типы. Дифтерийный токсин: действие на организм, единицы измерения силы токсина, получение антитоксина. Опишите методику определения токсиногенности дифтерийной культуры (реакция преципитации в агаре); наиболее частая локализация местного процесса при дифтерии. Какие материалы берут от больных, а также при исследовании на носительство дифтерийной палочки? Опишите по дням ход исследования и результаты, которые наблюдаются при выделении токсигенного возбудителя дифтерии: как формулируется ответ на разных этапах исследования? Опишите по дням ход исследования и результаты, которые наблюдаются при выделении нетоксигенной дифтерийной палочки. Методы дифференцировки истинных дифтерийных палочек и дифтероидов: морфология, биохимическая активность, пробы на уреазу и цистиназу по антигенной структуре и вирулентности. Иммунитет при дифтерии: характер иммунитета, методы определения напряжённости иммунитета, продолжительность иммунитета после плановых прививок. Специфическая профилактика дифтерии; какие препараты применяются, с какого возраста начинают прививки? Препарат для специфической терапии дифтерии; что содержит, как получен, в каких единицах дозируется, как вводится?

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Написать в дневнике название по-латыни возбудителя столбняка и схему введения гетерологичной сыворотки (по Безредке).

 

Самостоятельная работа студента на практическом занятии

1. Изучение морфологии грамотрицательных палочек и патогенных анаэробов. Промикроскопируйте и зарисуйте окрашенные по Граму препараты чистых культур синегнойной палочки, протея, возбудителей анаэробной газовой инфекции, столбняка и ботулизма. Название возбудителей под рисунками напишите по-латыни.

2. Изучение культуральных свойств синегнойной палочки и протея. Просмотрите готовые посевы синегнойной палочки и протея на скошенном агаре и в чашках Петри с МПА. Обратите внимание на пигмент синегнойной палочки и характер роста протея.

3. Ознакомление с аппаратурой для выращивания анаэробов. Посмотрите аппараты Аристовского, анаэростат, эксикатор, трубки Вейон-Виньяля, посев по Фортнеру, среду Китта-Тароцци. Устно опишите, как создаются анаэробные условия в этих аппаратах и средах.

4. Продолжение исследования отделяемого раны (2-й день). Изучите характер роста микробов на средах Китта-Тароцци, Вильсон-Блера, молоке. Приготовьте мазок из среды Китта-Тароцци, окрасьте по Граму, промикроскопируйте, зарисуйте. Сделайте посев по Вейнбергу для выделения чистой культуры. Опишите проделанную работу.

5. Усвоение схемы исследования материала от больных на наличие:

а) неспорообразующих анаэробов;

б) грамотрицательных палочковидных микроорганизмов (синегнойная палочка, протей, кишечная палочка).

Расскажите устно и запишите схему исследования в дневнике.

6. Усвоение по таблицам микробиологической диагностики столбняка. Расскажите устно и запишите схему исследования в дневнике.

7. По таблицам разберите схему исследования при ботулизме. Изучите демонстрационный набор препаратов для диагностики и лечения ботулизма.

8. Изучение диагностических, профилактических и лечебных препаратов, применяемых при раневых анаэробных инфекциях. Посмотрите препараты, прочитайте этикетки, охарактеризуйте каждый препарат по схеме, приведенной на предыдущем занятии.

9. Исследование слизи зева на носительство дифтерийной палочки. Возьмите стерильным тампоном слизь из зева друг у друга и посейте на свёрнутую сыворотку. В журнале запишите паспортные данные обследуемого студента и проделанную работу (1-й день).

ЗАНЯТИЕ 27