Методы обнаружения возбудителя инфекции в материале от больного

Для обнаружения возбудителя в материалеот больного применяют следующие методы:

- микроскопические (бактериоскопические, микоскопические, вирусоскопические, направленные соответственно на выявление в исследуемом материале от больного бактерий, грибов, вирусов);

- микробиологические (бактериологические, микологичес­кие, вирусологические), предполагающие выделение чистой культуры микроорганизма;

- биологические (биопробы).

Микроскопические методы используют для обнаружения возбудителей (бактерий, грибов, простейших, вирусов) в окрашенных мазках или в нативных пре­паратах из исследуемого мате­риала с помощью световой микроскопии. Достоинства этого метода состоят в быстроте, про­стоте и невысокой стоимости, недостатки - в невозможности определения вида микроорганизмов и невысокой чувствительности (не менее 10⁶ микробных клеток в 1 мл или 1 г исследуемого материала).

Микроскопический метод имеет, как правило, ори­ентировочное значение. При некоторых инфекциях (например, при гонорее, микозах и заболеваниях, вызванных простейшими) диагностическая ценность микроскопического исследования высокая, являясь основанием для поста­новки окончательного диагноза заболевания.

Вирусоскопические исследования имеют ограничения, связанные с необходимостью использования дорогостоящего прибора - электронного микроскопа. Для диагностики вирусных инфекций могут применяться цитологичес­кие методы, выявляющие внутриклеточные включе­ния в зараженных клетках (например, телец Бабеша-Негри при бешенстве, телец Пашена и Гварниери при оспе или цитомегалических клеток при заболе­ваниях, вызванных цитомегаловирусом).

Микробиологические методы основаны на выделении чистой культуры возбудителя из материала, полученного от больного, с ее последующей идентификацией до уровня вида на основании изучения биологических свойств микроорганизма, а в последнее время по данным методов генодиагностики (гибридизация ДНК, ПЦР). Микробиологические методы отличаются высокой чувстви­тельностью и специфичностью, являясь «золотым» стандартом при диагностике многих инфекций. Располагая чистой культурой возбудителя, можно определить факторы вирулентности и чувстви­тельность к антибиотикам, что необходимо для рационального выбора этиотропной терапии. Ограничения микробиологического метода могут быть связаны с низкой скоростью размно­жения возбудителей, требовательностью к условиям культивирования (состав питательных сред, необходимость создания особых условий в зависимости от типа дыхания микроорганизма т.д.), а порой – невозможностью культивирования микроорганизма в искусственных условиях.

Для эпидемиологического анализа вспышек инфекционных заболеваний проводят типирование культур возбудителей, вы­деленных от разных больных и носителей патогенных микробов, а также из внешних объектов, являющихся возможными источниками инфицирования (вода, пищевые продукты и т.д.) с целью определения их биовара, хемовара, серовара, фаговара и т.д.

Микологические исследования с целью выделения чистых культур грибов выполняются при диагностике ряда микозов (кандидозы, глубокие микозы и т.д.).

Вирусологический метод является «золотым» стандартом в диагностике многих вирусных инфекций, однако является достаточно трудоемким, что связано с особен­ностями хранения, транспортировки и обработки исследуемого материала, использованием культур клеток, сложностью и дли­тельностью культивирования ряда вирусов. Идентификацию выделенного вируса осу­ществляют, как правило, иммунологическими методами на основании изучения антигенной структуры, а также с помощью биохимических и молекулярно-биологических методов (ПЦР, гибри­дизация НК, и др.).

Биологические методы (биопробы) направлены на выделение микроорганизма или на обнаружение его токсинов путем заражения чувствительных лабораторных животных материалом, по­лученным от больного. Этот метод используют для выделения чистой культуры возбудителя в тех случаях, когда микроорга­низмы не растут или плохо культивируются на питательных средах, для дифференциации патогенных микробов или для определения их вирулентности. В настоящее время применение биопроб ограничено из-за соображений гуманности, финансовых трудностей, существованием повышенного риска заражения персонала лаборатории и в ряде случаев – длительностью выполнения биопробы, а также неспособностью современных штаммов микроорганизмов воспроизводить типичную инфекцию у чувствительного лабораторного животного. Наиболее часто биопробу применяют для выделения чистых культур возбудителей зоонозных инфекций (например, туляремии), а также для обнаружения ботулинистического токсина.

Иммунохимические методы диагностики возбудителя или его антигенов в материале от больного

Метод иммунофлюоресценции (ИФ) позволяетобнаружить в материале от больного или в зараженных вирусом клетках антигены бактерий и вирусов с по­мощью специфических антител, меченных флюорохромами.

Иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ). Сущность метода заключается в том, что исследуемый материал, содержащий вирусы, обрабатывают специфическими антителами, образовавшиеся иммунные комплексы осаждают высокоскоростным центрифугированием, а затем вирусы в составе иммунных комплексов выявляют с помощью электронной микроскопии. ИЭМ позволяет зна­чительно повысить чувствительность и специфичность вирусоскопического метода. Разработаны твердофазные методы ИЭМ, сущность которых состоит в предварительной фиксации специфических антител (немеченных или меченных частицами золота) на сетках для электронной микроскопии с последующей обработкой сеток исследуемым вируссодержащим материалом и выявлением связанных антителами вирионов с помощью электронной микроскопии.

Другие серологические реакции (РИФ, ИФА, РИА, РНГА, РП) также могут применяться для обнаружения антигенов бактерий и вирусов в материалах от больного.

Биохимические и молекулярно-биологические методы диа­гностики

Метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ) используют для обнаружения продуктов метаболизма микроорганизмов (летучих жирных кислот, спиртов, нелетучих органических кислот и т.д.) в исследуемом материале.

Методы генодиагностики. Специфические фрагменты ну­клеиновых кислот (НК) различных возбудителей можно обнаружить в исследуемом материале от больного с помощью методов гиб­ридизации нуклеиновых кислот (ДНК-зондов) или чаще - ПЦР, которая широко используется как высокочувствительный экспресс-метод для постановки предварительного диагноза при различных инфекциях. Ограничения ПЦР могут быть обусловлены высокой изменчивостью НК некоторых микроорганизмов, а также неадекватным подбором праймеров для реакции, что обеспечивает ложноотрицательные результаты, или же загрязнением реакционной смеси микроорганизмами или фрагментами их НК, приводя к возникновению ложноположительных реакций.

Серодиагностика и аллергодиагностика

Серодиагностика (serum – сыворотка). Метод основан на обнаружении антител в сыворотке крови больного и определении динамики на­растания их титра в ходе заболевания. Для серодиагностики инфекционных болезней применяют различные иммунологические реакции (РА, РСК, РНГА, ИФА, ИФМ и т.д.), используя в качестве антигенов живые культуры микроорганизмов или диагностикумы (инактивированные взвеси микроорганизмов или антигены из них, полученные химическим путем).

Серологические исследования проводят также для эпидемиологического анализа инфекционной заболеваемости (определение специфических антител у здоровых лиц, свидетельствующее о перенесении ими инфек­ции или о контакте с соответствующим возбудителем), а также для определения уровня специфических антител с целью оценки эффективности вакцинопрофилактики.

При серологических исследованиях учи­тывается диагностический титр выявленных антител (максимальное разведение исследуемой сыворотки, дающее положительный результат). Наиболее информативными являются серологические исследования парных сывороток крови больного, взятых в начале болезни и через разные промежутки времени в процессе ее развития. Диагнос­тическое значение имеет нарастание титра в 4 раза и более.

Методы серодиагностики отличаются высокой специфичностью и чувствительностью. В последние годы широкое распространение получил метод ИФА.

Серологические реакции, несмотря на ряд достоинств, имеют некоторые ограничения, связанные с возможностью возникновения ложноотрицательных и ложноположительных реакций. Ложноотрицательные реакции могут появляться в результате нейтрализации антител избытком микроба или его антигенов в организме больного, а также в результате неоптимальных соотношений антигенов и антител при постановке реакции. Ложноположительные (псевдоиммунологические) реакции могут возникать при использовании гемолизированной или загрязненной микроорганизмами сыворотки крови, при нарушениях соотношения альбуминов и глобулинов, являться результатом перекрестных иммунологических реакций. Ложноположительные реакции могут появляться у беременных женщин, наркоманов, больных тяжелыми хроническими болезнями (красная волчанка, ревматоидный артрит, хронические гепатиты и т.д.) и инфекциями (бруцеллез и др.)

Аллергодиагностика. Наиболее часто при диагностике ряда инфекционных заболеваний (туберкулез, бруцеллез, туляремия и др.) ставят внутрикожные аллергические пробы для выявления гиперчувствительности замедленного типа к аллергенам микробов. Могут использоваться также методы аллергодиагностики in vitro, позволяющие оценить состояние специфической сенсибилиза­ции лейкоцитов крови в отношении определенного антигена, например, реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ), реакция лейкоцитолиза (повреждения нейтрофилов) в присутствии специфического микробного антигена.