Лабораторная диагностика дифтерии

Дифтерия - острое инфекционное заболевание, вызываемое дифтерийной палочкой (Corynebacterium diphtheriae), характеризующеесяместным фибринозным поражением слизистых оболочек рото- и носоглотки (diphthera – пленка), а также тяжелой интоксикацией с поражением сердечно-сосудистой, нервной системы и надпочечников. Лабораторная диагностика дифтерии осуществляется в соответствии со схемой 14.

 

Схема 14. Микробиологическая диагностика дифтерии

Микроскопический метод в настоящее время фактически не применяется из-за его низкой информативности в связи с субъективизмом учета и выполняется только по требованию лечащего врача. Микроскопии подвергают мазки, окрашенные по Граму, метиленовым синим, по Нейссеру (для выявления включений волютина). Дифтерийные палочки ( Corynebacteriumdiphtheriae ) при окраске по Нейссеру содержат полярно расположенные темно-синие, почти черные, включения волютина и располагаются в виде римских цифр V или Х, тогда как сходные с ними дифтероиды и ложнодифтерийные бактерии ( Corynebacteriumpseudodiphtheriae ) зерен волютина не имеют и располагаются в виде частокола. Разработан также метод прямого флюорохромирования дифтерийных палочек корифосфином, окрашивающим включения волютина в красно-коричневый цвет, а цитоплазму в зеленый или желтый цвет, что позволяет повысить эффективность бактериоскопического метода.

Бактериологический метод -основной метод диагностики дифтерии. Исследуемый материал засевают на одну из специальных питательных сред для культивирования дифтерийных палочек, наиболее часто на среду Клауберга (МПА с гли­церином, дефибринированной кровью и теллуритом натрия, задерживающим рост сопутствующей непатогенной микрофлоры). На среде Клауберга Corynebacterium diphtheriae образует 2 типа колоний:

а) серовато-черного цвета с радиальной исчерченностью поверхности, напоминающие цве­ток маргаритки или розетку (биовар gravis);

б) черные, круглые, выпуклые колонии колонии за счет восстановления теллурита (биовар mitis).

В мазке из типичной для дифтерийной палочки колонии обнаруживают грамположительные палочки булавовидной формы, расположенные в виде римских цифр V или Х, содержащие зерна волютина (рис. 16). Оставшуюся часть колонии пересевают на кровяной МПА для выделения чистой культуры.

 

 

Рис. 16. Возбудитель дифтерии - Corynebacteriumdiphtheriae. Окраска по Нейссеру. Расположение в виде римских цифр V или Х, включения волютина по полюсам. х900

 

Идентификацию выделенной культуры проводят с учетом, прежде всего, ключевых свойств (токсигенность, наличие цистиназы). Токсигенность обычно определяют с помощью реакции преципитации в геле («чашечный» метод). Для этого в чашку Петри с питательной средой (МПА, 15—20 % лошадиной сыворотки, 0,3 % мальтозы, 0,03 % цистина) накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную анти­токсической противодифтерийной сывороткой (5000 АЕ/мл), чашку подсушивают 30 минут в термостате, после чего засевают штрихами исследуемые культуры перпендикулярно полоске бумаги. В качестве контроля используют токсигенную куль­туру. Посевы инкубируют в термостате при 37⁰ С в течение 18-20 часов. При наличии токсигенности в местах соединения ток­сина с антитоксическими антителами в питательной среде образуются белые линии преципитата, напоминающие усики. Для определения токсигенности дифтерийных бактерий также разработаны ИФА и ПЦР.

Цистиназу у выделенных культур (проба Пизу) определяют путем посева методом укола петли исследуемой культуры на цистиновый МПА с азотнокислым свинцом. Посевы помещают на сутки в термостат при 37⁰ С. При наличии цистиназы в среде образуется почернение (образование сульфида свинца) по ходу укола, вокруг которого появляется коричневое облачко.

Выделенную культуру идентифицируют и дифференцируют от сходных с ней непатогенных коринебактерий по биологическим свойствам (табл. 16). Для определения уреазы петлю исследуемой культуры вносят в пробирку, содержащую спиртовый раствор мочевины и индикатор феноловый красный. Пробирку выдерживают 30 минут в термостате при 37⁰ С, при наличии уреазы содержимое пробирки окрашивается в красный цвет.

При выделении нетоксигенной культуры ставят реакцию агглютинации с противодифтерийной сывороткой для выявления видового антигена Corynebacterium diphtheriae.

Серологический метод – РА, РНГА с целью определения антител в парных сыворотках крови больных дифтерией.

Таблица 16. Биологические свойства коринебактерий

Вид	Волютин	Гемолиз	ферментация	токсин	цистиназа	уреаза	РА с ПДС
сахарозы	глюкозы	крахмала
C. diphtheriae биовар биовар	+ +	- +	-	+ +	+ -	± ±	+ +	- -	+ +
C.xerosis	±	-	+	+	-	-	-	-	-
C. pseudodiphtheriae	±	-	-	-	-	-	-	+	-

 

Самостоятельная работа студентов

 

1. Морфологические свойства возбудителя дифтерии – Corynebacterium diphtheriae (мазок из чистой культуры, окраска по Нейссеру). Дифтерийные коринебактерии в препарате расположены в виде римской цифры V или X, по полюсам содержат темно-синие включения волютина.

2. Бактериологический метод. Изучение культуральных, ферментативных и антигенных свойств дифтерийной культуры:

· учет роста дифтерийной палочки на среде Клауберга (МПА с теллуритом натрия, глицерином и дефибринированной кровью). Колонии мелкие, круглые с уп­лотнением в центре, при сплошном росте поверхность культуры выглядит в виде шагреневой кожи. Колонии биовара gravis серые, радиально исчерчены, напоминающие розетку, колонии биовара mitis - черные, круглые, выпуклые. Де­монстрацию описать, зарисовать;

· биохимические свойства коринебактерий представлены де­монстрацией в соответствии с таблицей. Описать, зарисовать;

· определение токсигенности культур дифтерийных бактерий с помощью реакции преципитации в геле. На цистиновый МПА в чашке Петри нанесена полоска фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической про­тиводифтерийной сывороткой, перепендикулярно которой засеяны исследуемые культуры. Если культура токсигенна, в мес­тах соединения токсина с антитоксином образуется преципитат в виде белых линий (усы);

· цистиназная активность (проба Пизу) на столбике МПА с цистином посевом в виде укола. При наличии фермента отмечается почернение среды по ходу укола (образование сульфида свинца) и коричневое облако вокруг. Учесть демонстрационную реакцию;

· наличие уреазы определяют в растворе с мочевиной и индикатором феноловым красным. При наличии фермента сре­да приобретает красный цвет. Учесть демонстрацию.

3. Серологический метод. Учесть демонстрационную РНГА для определения напряженности антитоксического иммунитета при дифтерии.