Микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций

Методы микробиологической диагностики стафилококковых забо­леваний отражены в схеме 1. Выполняется следующий комплекс методов исследования.

Бактериоскопический метод – микроскопия мазков из материала от больного, окрашенных по Граму. Выявление в мазках кокков, располагающихся небольшими группами по 2-3 бактерии; типичное расположение в виде гроздьев винограда характерно для чистых культур стафилококка (рис. 1 – цветная вкладка).

Бактериологический метод. Исследуемыйматериал засевают на чашки с желточно-солевым (ЖСА) и кровяным МПА, инкубируют при 37⁰С сутки. На 2 день учитывают характер

роста колоний на обеих средах. На желточно-солевом агаре колонии стафило­кокка имеют ровные края, гладкую поверхность, вокруг колонии образуется радужный венчик в результате расщепления лецитина яичного желтка ферментом лецитовителлазой; цвет пигмента колоний варьирует от золотистого до белого. На кровяном МПА вокруг колоний образуются зоны

гемолиза. Из типичных для стафилококка колоний делают мазок, окрашивают его по Граму, микроскопируют. Оставшуюся часть колонии пересевают на скошенный МПА для получения чистой культуры. На 3 день проводят идентификацию выделенной культуры стафилококка с дифференциацией основных видов в соответствии с таблицей 2, определяют чувствительность к антибиотикам методом бумажных дисков и фаговар (набор для фаготипирования состоит из фагов 21 типа, разделенных на 4 группы; при внутрибольничных инфекциях наиболее часто встречаются фаговары 77 и 80).

 

Таблица 1. Этиология бактериальных раневых и гнойно-воспалительных инфекций

Аэробы

Анаэробы

Грамположительные бактерии Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Erysipelotrix rhusiopathiae Грамотрицательные бактерии Burkholderia cepacia, Citrobacter koseri, Edwardsiella tarda, Eikenella corrodens, Enterobacter spp, Escherichia coli, Haemophylus influence, Klebsiella spp, Listeria monocytogenes, Moraxella catarrhalis, Proteus spp, Pseudomonas spp, Salmonella enterica, Serratia spp, Spirillum minus, Streptobacillus moniliformis, Vibrio vulnificus

Неспорообразующие грамположительные бактерии Bacteroides spp, Prevotella spp, Porphiromonas spp, Fusobacterium spp, Veilonella spp Неспорообразующие грамотрицательные бактерии Peptostreptococcus spp, Propionibacterium spp Cпорообразующие грамположительные бактерии Clostridium perfringens, Clostridium novy, Clostridium oedematiens, Clostridium septicum, Clostridium sordelli, Clostridium histolyticum, Clostridium sporogenes, Clostridium ramosum

 

 

Схема 1. Микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций
Материал: гной, раневое отделяемое, пунктаты из полостей и абсцессов, кровь, мокрота, моча, ликвор, рвотные массы, испражнения, остатки пищи.
Микроскопический метод Выявление грамположительных кокков (группами по 2-3 клетки) в мазках из материала от больного, окрашенных по Граму Серологический метод РНГА или РН для определения α-антитоксина в сыворотке крови больных хроническими стафилококковыми инфекциями. ИФА для определения антител к стафилококку. Имеет вспомогательное значение Бактериологический метод 1 день. Посев материала на чашки с желточно-солевым (ЖСА), кровяным МПА, сахарным МПБ. 2 день -учет характера роста колоний. На ЖСА колонии стафило­кокка с ровными краями, гладкой поверхностью, радужным венчиком вокруг, цвет - от золотистого до белого.	На кровяном МПА - зоны гемолиза, в МПБ –равномерное помутнение. В мазке из колоний в окраске по Граму – кокки в виде гроздьев винограда. Пересев оставшейся части колонии на скошенный МПА для получения чистой культуры, а с сахарного МПБ на кровяной МПА и ЖСА для получения изолированных колоний. 3 день - идентификация выделенной культуры стафилококка, дифференциация видов по биохимическим свойствам, определение чувствительности к антибиотикам и фаговара. Выделение чистой культуры с ЖСА и кровяного МПА. 4 день.Заключение о виде стафилококка. Идентификация культуры, выделенной из сахарного МПБ 5 день.Заключение о виде стафилококка, выделенного из сахарного МПБ.

Таблица 2. Дифференциация основных видов стафилококка

 

Признаки	Виды стафилококков
S. aureus	S. epidermidis	S. saprophyticus
Плазмокоагулаза	+	-	-
Лецитиназа	+	-	-
Альфа-токсин	+	-	-
Анаэробная ферментация глюкозы	+	+	-
Анаэробная ферментация маннита	+	-	-
Чувствительность к новобиоцину	S	S	R

 

Обозначения: (+) – наличие признака; (-) – отсутствие признака; S - чувствительный; R – резистентный.

Для выявления плазмокоагулазы цитратную плазму крови кролика разводят в 2 раза, разливают по 0,4 мл в пробирки, куда вносят петлей культуру стафилококков. Резуль­таты регистрируют через 2, 4, 24 часа. При наличии плазмокоагулазы об­разуется сгусток.

В некоторых случаях у выделенных чистых культур стафилококка определяют наличие ДНК-азы, каталазы, лизоцимной активности, фибринолизина, гиалуронидазы.

Лизоцимную активность выявляют по зонам просветления вокруг колоний стафилококка при его посеве на МПА в чашках Петри с культурой Micrococcus luteus.

Определение ДНК-азы. Суточную агаровую культуру стафилококка засевают на МПА в чашке Петри, содержащий ДНК. После инкубации посевов при температуре 37⁰ С в течение 18-24 часов поверхность МПА заливают 1 N раствором соляной кислоты. Наличие ДНК-азы характеризуется появлением зоны просветления вокруг колоний.

Каталазный тест. Чистую культуру стафилококка вносят в каплю 3%-10%-го раствора перекиси водорода на стекле и растирают круговыми дви­жениями. При наличии каталазы перекись водорода разлагается с образо­ванием пузырьков кислорода.

Cерологический метод в диагностике стафилококковых инфекций имеет вспомогательное значение, используясь, в основном, для диагностики хронических процессов (остеомиелит, септикопиемия и др.). Для определения антител к токсину стафилококка применяют РНГА с эритроцитарным диагностикумом, нагруженным α-токсином стафилококка или РН (реакция нейтрализации гемолитической активности стафилококкового токсина антитоксинами сыворотки крови больного в присутствии эритроцитов кролика). У здоровых лиц титр стафилококкового антитоксина составляет 0,5-4 АЕ. Разработан также ИФА.

 

Клинически значимые виды стафилококка Коагулазоположительные: S. aureus, S. hyicus Коагулазоотрицательные: S. epidermidis, S. saprophyticus, S. haemolyticus, S.hominis

 

Самостоятельная работа студентов

1. Микроскопия мазков из чистой культуры золотистого стафилококка – Staphylococcus aureus. Стафилококки окрашиваются по Граму положительно, выглядят в виде гроздьев винограда

2. Учет характера роста золотистого стафилококка (демонстрация) на ЖСА (расщепление лецитина в виде радужного венчика вокруг колоний) и кровяном МПА (гемолиз).

3. Дифференциация основных видов стафилококка (таблица 2) – (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus по образованию плазмокоагулазы, лецитиназы, альфа-токсина, ферментации маннита и глюкозы в анаэробных условиях - демонстрация).

4. Учет теста на антибиотикорезистентность методом бумажных дисков (демонстрация).

5. Определение фаговара стафилококка (демонстрация).

6. Знакомство с препаратами, используемыми для диагностики, профилактики и лечения стафилококковых и стрептококковых инфекций.

- стафилококковая вакцина - взвесь клеток коагулазоположительных штаммов S.aureus, убитая нагреванием. Используется для лечения вяло текущих стафилококковых инфекций;

- антифагин стафилококковый - экстракт из культур патогенных стафи­лококков, инактивированных при 100⁰ С, профильтрованный через бакте­риальный фильтр. Применяется для лечения хронических пиодермий;

- иммуноглобулин человеческий противостафилококковый - гамма-глобу­линовая фракция сыворотки крови, содержащая стафилококковые антитокси­ческие антитела. Применяется с лечебной целью;

- стафилококковый бактериофаг (жидкий) - фильтрат фаголизата стафилококка. Применяют наружно, внутрикожно и внутримышечно для лечения;

- диагностические стафилококковые фаги - набор типоспецифических фагов для фаготипирования стафилококков;

- стафилококковый анатоксин (очищенный адсорбированный) – получают из нативного анатоксина (токсин, обезвреженный формалином) путем осаждения трихлоруксусной кислотой и этанолом, с последующей адсорбцией на гидроксиде алюминия. Применяется для актив­ной иммунизации с целью профилактики и лечения стафилококковых инфекций;