Микробиологическая диагностика эшерихиозов

Среди видов Escherichia coli семейства Enterobacteriaceae, наряду с непатогенными кишечны­ми палочками - представителями нормальной микрофлоры кишечника, имеются их патогенные варианты, в том числе:

· энтерогеморрагические кишечные палочки (ЭГКП) - возбудители энтерогеморрагического эшерихиоза с гемолитико-уремическим синдромом);

· энтероинвазивные (ЭИКП), вызывающие заболева­ния, сходные с дизентерией;

· энтеротоксигенные (ЭТКП), вызывающие холероподобный эшерихиоз или диарею путешественников;

· ЭПКП (энтеропатогенные) - возбудители детских колиэнтеритов и других кишечных инфекций, а также уропатогенные эшерихии, поражающие мочевыводящие пути.

Наиболее часто встречающиеся серовары патогенных эшерихий, входящих в состав перечисленных групп, представлены в таблице 11.

 

Таблица 11. Серовары наиболее часто встречающихся патогенных эшерихий.

Энтеротоксигенные	Энтеропатогенные	Энтероинвазивные	Энтерогеморрагические
О6, О8, О15, О20, О25, О27, О63, О78, О80, О85, О115, О128, О139, О148, О153, О159, О168	О18, О44, О55, О111, О112, О114, О119, О125-128, О142	О28, О29, О124, О136, О143, О144, О152, О164, О167	О157, О126, О111

 

Часть эшерихий относится к условно-патогенным микроорганизмам, способных вызывать оппортуни­стические инфекции (пневмонии, нагноения ран и полостей, ме­нингиты, сепсис и т.д.). При накоплении в пищевых продуктах эшерихии могут стать причиной пищевого отравления. Методы микробиологической диагностики эшерихиозов отражены в схеме 11.

Бактериоскопический метод в диа­гностике эшерихиозов в практике бактериологических лабораторий не применяется из-за сходства морфологических и тинкториальных свойств патогенных и условно-патогенных энтеробактерий.

Бактериологический метод является основным методом диагностики эшерихиозов. Для выделения эшерихий используют среды Эндо, Левина и среду Мак-Конки с сорбитом для выделения Escherichia coli 0157: HIиз группыЭГКП.

 

Схема 11. Микробиологическая диагностика эшерихиозов

Экспресс-методы(индикацияпатогенной E.coli или ее продуктов в исследуемом материале) ДНК-зонды или ПЦР для выявления специфического фрагмента ДНК патогенной E.coli РИФ

 

 

Через 18 —24 ч инкубации при 37⁰ С изучают характер колоний (гладкие, выпуклые, с ровными краями колонии, окрашенные в красный цвет в результате разложения лактозы, с характерным металлическим блеском), выросших на плотных питательных средах. Патоген­ные эшерихии по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам не отличаются от обычных эшерихий, обитающих в кишечнике человека. Исключение составляют лактозоотрицательные ЭПКП. Принадлежность выделенных микро­организмов к патогенным эшерихиям устанавливают по ан­тигенной структуре с помощью ОРА со смесью специфических эшерихиозных ОК- сывороток и содержимого 10 лактозоположительных колоний. На среде Мак-Конки с сорбитом ЭГКП образуют бесцветные колонии, тогда как другие эшерихии фер­ментируют сорбит, образуя красные колонии.

При положительном результате РА оставшуюся часть колонии пересевают уколом в столбик и штрихом на поверхность скошенной части среды на комбинированную полуско­шенную полиуглеводную среду (например, Ресселя) с целью накопления культуры.

На 3-й день учитывают изменения на среде Ресселя. Ферментацию глюкозы с образованием кислоты или кислоты и газа выявляют по изменениям стол­бика агара (пожелтение и его разрывы среды в результате ферментации глюкозы в анаэробных условиях) и скошенной части (пожелтение в результате фер­ментации лактозы и сахарозы). При отсутствии ферментации углеводов среда приобретает щелочную реакцию за счет выделения аминов при разложении бел­ка и приобретает красный цвет. Проверяют чистоту выделенной культуры, опре­деляют ее биохимические свойства (посев на среды Гисса); проводят серотипирование путем постановки сначала ориентировочной РА на стекле с поливалентной ОК-сывороткой, а затем — развернутой РА с адсорбированными групповыми сы­воротками для определения ОК-серогруппы. Можно использовать латексные диагностикумы, покрытые соответствующи­ми антителами (реакция латексной агглютинации).

Антигенную формулу выделенной культуры определяют по результатам постановки развернутой РА с ОК сывороткой (или диагностическим иммуноглобулином) и жи­вой культурой (типирование по К-антигену), а также развернутой РА с ОК сывороткой и гретой (кипяченой в течение 1-2 ч) культурой с целью определения специфического О-антигена. Кипячение или автоклавирование разрушает поверхно­стно расположенный К-антиген, мешающий определению специфического О-антигена. Через сутки инкубирования при 37⁰ С гомологичные сыворотке штаммы должны агглютинироваться до титра или до половины титра сыворотки.

Культуру, положительно прореагировавшую в развернутой РА с одной из сывороток, засевают на дифференциально-диагностические среды для окончательной иден­тификации. Для выявления источника инфекции и путей заражения у вы­деленного штамма определяют фаговар и колициногеновар.

У вы­деленных культур или в патологическом мате­риале можно определить адгезивность и инвазивность микроскопическим методом с использованием культур ткани Нер-2 или HeLa, а также плазмиды вирулентности с помощью ДНК-зондов или ПЦР.

Для ускоренной идентификации возбудителя в исследуемом материале применяют прямой или непрямая РИФ.

Серологический метод является вспо­могательным, направленным на обнаружение антител и их динамики в процессе инфекции (исследование парных сывороток) с помощью РА, РНГА, ИФА.

Самостоятельная работа студентов

1. Бактериологический метод. Изучить этапы выделения чистой культуры возбудителя:

· Учет посевов фекалий от больного с подозрением на эшерихиоз на средах Эндо, Левина, Ресселя, Олькеницкого, скошенном MПA (демонстрация).

· Провести контроль чистоты выделенной культуры. Со ско­шенного МПА приготовлен мазок, окрашен по Граму. Промикроскопировать и зарисовать демон­страционный препарат кишечной палочки. Escherichia coli – беспорядочно расположенные грамотрицательные палочки с закругленными краями.

· Идентификация выделенной культуры возбудителя поантигенным свойствам. Учесть ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с комплексной ОВ-коли сывороткой (О-111, О-55, О-26) и типовыми О-коли сыворотками О-III, 0-55, О-26. Учесть развернутую реакцию агглютинации, по­ставленную с живой и кипяченой культурами и типовой сывороткой, с которой была положительная ориентировочная реакция агглютинации (демонстрация). Положительное заклю­чение выдается только при положительной РА с убитой культурой (обнаружение специфического О-антигена).

2. Серологический метод. Учет демонстрационных реакций (РА, РНГА, ИФА) в парных сыворотках больных с целью определения нарастания титра антител к возбудителям эшерихиозов.

3. Биопрепараты для диагностики эшерихиозов: типовые агглютинирующие 0-коли сыворотки 0-111,0-55, 0-26.